基于正交設計探究光照、溫度、濕度對烤煙成熟生理的影響

趙 喆，米 強，盧紹浩，張嘉雯，來 苗，王 坤，趙銘欽

（1.山東中煙工業有限責任公司 濟南卷煙廠，山東 濟南 250104；2.浙江中煙工業有限責任公司 技術中心，浙江 杭州 310024；3.上海煙草集團有限責任公司 技術中心，上海 201315；4.河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002）

0 引言

隨著全球氣候變暖現象的加劇，不利氣象因素對農業生產的影響日益增大［1］，光照、溫度、濕度作為主要的生態因子，影響著植物生長發育、成熟衰老的過程。植物光合作用隨光照強度的變化而瞬時變化［2］，當光照強度超過一定范圍后，光合效率保持在最大值，過剩的光照強度易對細胞造成光損傷［3］。與正常葉片相比，高光照強度下鼠尾草葉片表現出更強的光保護需求，且其PSⅡ受損，葉片衰老加劇［4］。在連續光照情況下，隨著光照強度的增加，生菜葉片內活性氧（ROS）的產生及脂質過氧化程度也逐漸增加［5］。

同時，溫度作為最重要的環境因子之一，可通過調控凈同化速率［6］和光合作用［7］影響植株生長。高溫下植物體內葉綠素降解加快，活性氧增多，細胞易受損傷［8-9］，據前人研究，溫度大于35 ℃時超氧化物歧化酶（SOD）活性會降低［10］；35～40 ℃時，凈光合速率也會下降［11］。熱處理提高了大豆體內乙烯含量，降低了光合作用速率和蔗糖含量，抑制了關鍵酶的促抗氧化劑活性，會導致葉片早衰［12］。同樣，空氣相對濕度也會影響植株光合作用及生理特性［13-14］。

目前，有關光照、溫度對植物成熟衰老影響的研究較多，但涉及濕度影響的研究較少。因此，本文通過選取大田植物生長環境中最重要的3個氣象因素，利用正交實驗設計方法，初步探究不同因子下葉片光合特性、抗氧化系統的動態變化，以期為解析不同濕度條件對植株成熟的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗于2016年在江西省撫州市黎川縣（東經116.52°，北緯26.89°）開展。供試材料為當地主栽品種云煙87。土壤為紅壤土，其理化性狀：pH值7.22，有機質8.72 g/kg，堿解氮51.27 mg/kg，速效磷16.84 g/kg，速效鉀5.14 g/kg。試驗地位于平坦開闊地塊，通風良好，排灌、通電方便。煙苗于3月26日統一移栽，株距0.5 m，行距1.2 m，四周及各處理間設保護行，大田管理同當地常規水平一致。

1.2 試驗設計

依據前人研究［15-17］，本試驗采取正交試驗方法。根據其設計原則［18-19］，利用SPSS 21.0軟件進行3因素3水平的正交設計，具體設計如表1所示。選擇不同光照強度（A）水平為50%（A1）、85%（A2）和120%（A3）3種自然光照強度，平均每日午間光照強度約為465.5×100、791.35×100、1117.2×100 lx；溫度（B）水平為（29±1） ℃（B1）、（33±1） ℃（B2）、（37±1） ℃（B3）3種；濕度（C）水平為（64±1）%大氣相對濕度（RH）（C1）、（73±1）% RH（C2）、（82 ±1）% RH（C3）3種。

表1 三因素三水平正交設計表

不同處理通過大棚溫室精確調控煙株成熟期光照強度、溫度、濕度3個指標。每個處理煙株約90株，通過透明無滴膜、遮陽網及植物燈（棚鮮牌36W）調控光照強度，并用照度計（TES-1330A）測定各處理光照強度；通過制冷機（YJL-18）、加濕器（浩奇HQ-2008A6）、除濕器（多樂信DR-1382L）、風機（貝德爾FZY-400）、控溫插座（YWK-F）、控濕插座（W2105）調控各處理所需溫、濕度條件。

大棚于6月20日（烤煙成熟中后期）搭建完畢并開始處理，每隔6 d各處理取樣測定其生理指標，取樣部位為從下至上第15～16葉位，每次處理3個重復，共取樣3次。

1.3 測定項目與指標

光合色素用80%丙酮提取，按照Lichtenthaler等［20］的方法測定其含量。抗氧化酶類活性根據Wei等［21］的方法，采用NBT光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性。移栽后96 d，在上午9:30～10:30利用快速光合測定儀（ECA-PC0401）測定葉片光合速率，每個處理5次重復。

1.4 數據分析

采用SPSS 21.0軟件進行正交設計、方差分析，采用Microsoft Excel 2013軟件制作表格，Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 光照強度、溫度、濕度3個因子對成熟后期葉片光合速率的影響

2.1.1 不同因子水平下烤煙葉片光合速率影響的邊際值分析 光合速率的邊際值為所有處理中某一因子水平下光合速率的平均值，可以表示某因子水平變化對葉片光合速率的影響效應。由各因子光合速率邊際值可知（表2），隨著光照強度的升高，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢，3個光照強度水平下以85%光照強度時光合速率最高，85%和120%光照強度對應的光合速率間差異未達到5%顯著水平。隨著溫度的升高，光合速率呈逐步降低的趨勢，38 ℃時對應的光合速率顯著低于29 ℃的。隨著空氣相對濕度的增加，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢，但差異未達到5%顯著水平。

表2 不同因子水平下烤煙葉片光合速率的邊際值

2.1.2 生態因子對烤煙葉片光合速率影響的主效應分析 采用正交試驗中常用的極差分析法［15，17］進行數據分析。極差越大，即因子的效應值越大，表明因子變化對結果的影響越大。由表3可以看出，3個生態因子對于光合速率的影響均達到極顯著水平，且對光合速率的影響排序為光照強度＞溫度＞濕度，光照強度為光合速率的主要影響因子。

表3 各因子對光合速率影響的極差 μmol/（m2·s）

2.2 光照強度、溫度、濕度3個因子對成熟后期葉片光合色素含量的影響

2.2.1 不同因子水平下烤煙葉片光合色素含量影響的邊際值分析 由圖1A可知，隨著光照強度的增加，3個時期葉綠素a（Chl a）含量均呈降低的趨勢，且以移栽后90 d弱光條件下降幅度最大；隨著溫度的升高，3個時期Chl a含量同樣呈下降的趨勢；從濕度變化可以看出，移栽后90 d在82%濕度條件下Chl a含量最高，移栽后96 d在73%濕度條件下Chl a含量最高，而移栽后102 d則在64%濕度條件下表現最好，但彼此間并無顯著差異。

由圖1B可知，葉綠素b（Chl b）含量隨著光照強度、溫度的增大而逐漸降低，但隨著濕度的增加呈現逐漸升高的變化趨勢。葉片衰老期間，葉綠素較易降解，而類胡蘿卜素（Carotenoids）較為穩定，故衰老期間葉片表現為黃色。

由圖1C可知，3個時期中Cars含量隨著光照強度的升高而增大，隨著溫度的升高而減小，其隨濕度的變化情況與Chl a含量隨濕度變化情況類似，都是移栽后90 d在82%濕度條件下、移栽后96 d在73%濕度條件下、移栽后102 d在64%濕度條件下Cars含量最高。

由圖1D可知，光照強度與Chl a/b值間存在正相關關系，隨著光照強度的增加，成熟后期3個階段Chl a/b值皆升高。同時，隨著溫度的升高，Chl a/b值同樣升高。濕度與Chl a/b值變化存在負相關關系：當濕度在64%條件下時，3個時期的Chl a/b值皆為最大。Chl a/b值大，表示Chl a降解較Chl b慢，即在相同葉綠素含量時，64%濕度條件下葉片對藍紫光的吸收不如其他濕度條件的。

圖1 不同因子水平下烤煙葉片Chl a、Chl b、Cars、Chl a/b值的邊際值

2.2.2 生態因子對烤煙葉片光合色素含量影響的主效應分析 由各因子對光合色素含量影響的極差可以看出（表4），光照強度對Chl a含量的影響最大，3個時期皆達到極顯著水平；隨著時間的增加，葉片Chl a含量對于外界光照強度及溫度的響應逐漸變弱。溫度和濕度條件下，Chl a的極差基本上未達到顯著水平。對于Chl b含量來說，光照強度為主要影響因子，溫度為次要影響因子，濕度影響最小。

表4 各因子對光合色素含量影響的極差

在Cars含量的極差中，光照強度在3個時期的極差均最大，3個時期均達到極顯著水平，其影響隨著時間的推移逐漸減弱。溫度對Cars含量影響的極差在各個時期變化較小。濕度因子在移栽后90 d對Cars含量影響的極差僅次于光照強度因子，在其他2個時期極差減小。

Chl a/b值對于3個因子的響應中，移栽后90 d，溫度對其影響的極差最大；其他2個時期，光照強度對Chl a/b值影響的極差最大，移栽后102 d時達到極顯著水平，濕度影響次之，溫度影響最弱。

2.3 光照強度、溫度、濕度3個因子對成熟后期葉片抗氧化酶類活性的影響

2.3.1 不同因子水平下葉片抗氧化酶類活性影響的邊際值分析 由圖2A可知，SOD活性分別隨著光照強度、溫度、濕度的增加而顯著降低。POD活性隨著光照強度和溫度的升高而增強，尤以不同光照強度下最為顯著；不同濕度水平下，在64%RH時3個時期的POD活性均為最高，之后隨著濕度的增加而顯著降低（圖2B）。CAT活性在不同因子水平下變化不一：隨著光照強度的增加，整體呈上升趨勢；隨著溫度的變化則呈先升高后下降的趨勢；而隨著濕度的增加，CAT活性呈逐漸降低的變化趨勢。

圖2 不同生態因子對烤煙葉片SOD、POD、CAT活性的邊際值

2.3.2 生態因子對葉片抗氧化酶類活性影響的主效應分析 極差的變化可以反映各因子影響力的變化。由表5可知，在光照強度、溫度、濕度3個因素中，光照強度對SOD、POD、CAT活性影響最大，是抗氧化酶類活性的主要影響因子，溫度對抗氧化酶活性影響次于光照強度，濕度影響最小。在不同時期，SOD、POD活性對光照強度的響應逐漸減弱，CAT活性對光照強度的響應逐漸增強，移栽后102 d時濕度對CAT活性的影響逐漸增強。

表5 各因子對抗氧化酶類活性影響的極差

3 討論

光合作用是植株體內物質形成的基礎［22-23］，作為一個復雜的生理過程，植物光合作用受外界環境因子調節，對環境變化極其敏感［24］。本研究表明，光照強度是影響葉片光合速率的關鍵因子，溫度為次要因子，濕度對光合速率的影響最小。隨著光照強度的增加，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢，表明高光照強度使葉片出現了光抑制現象；隨著溫度的升高，光合速率呈逐步降低的趨勢，光合作用減弱；隨著濕度的增加，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢；這與Xu［3］、Elias［25］等的研究結果一致。

光合色素包括葉綠素和類胡蘿卜素2類，葉綠素負責光能的吸收、傳遞和轉化，類胡蘿卜素則負責捕獲光能及光破壞防御［26］。在成熟后期不同階段，Chl a含量與光照強度、溫度呈負相關關系，但其最適濕度則隨著時間的推移而逐漸變小。Chl b的含量，在成熟后期不同階段，隨光照強度的升高而顯著降低，但對于溫度和濕度變化的響應并不靈敏。

脅迫條件下，植物能夠通過葉黃素循環進行熱耗散，減輕光氧化的傷害［27-28］。本研究中，高光照強度下Cars含量顯著增加，有利于植株消耗過剩的光能，保護葉片不受強光損傷；但高溫條件下Cars含量則較低。對于濕度來講，隨著葉片衰老程度的加劇，其最適濕度條件由82%、73%最終變為64%。可以推斷，烤煙成熟后期高溫、高濕條件可能會阻礙類胡蘿卜素的產生，影響葉黃素的循環，不利于葉片通過葉黃素循環耗散過剩光能。

光照強度減弱，Chl a/b值減弱，有利于捕獲漫射中占優勢的藍紫光，在一定程度上提高了光能的利用率，是植物對于弱光的適應反應；同時葉綠體對2，6-二氯酚靛酚的還原能力增加，葉綠體光合磷酸化活性提高［29］。當植物的光合機構接受的光能超過所能利用的限度時，則會發生光抑制，產生過剩激發能［30］。烤煙成熟后期，當外界濕度大時，Chl a/b值較低，若此時強光照射，植物會捕獲更多的藍紫光，使得光抑制現象嚴重加劇，造成光損傷及光合機構的破壞。僅從Chl a/b角度上考慮，高光照強度和低濕度條件較為相配。綜合邊際值結果可知，煙株成熟后期光照強度對光合色素含量影響最大，溫度和濕度條件是次要因子，光合色素含量受三者共同調控。

強光下，過剩的光能通過電子傳遞鏈與分子氧結合形成超氧陰離子自由基［31］。抗氧化系統中，SOD將超氧陰離子自由基轉化為H2O2，過剩的H2O2則被POD和CAT清除，以抵御細胞氧化損傷［32-33］。本研究表明，烤煙成熟后期SOD活性受光照強度、溫度、濕度3個因子共同調控，且隨三者的增大而降低。即植株在高光、高溫、高濕條件下，葉片對超氧陰離子自由基清除能力下降，根據自由基傷害假說［34］可知，膜脂過氧化作用加劇，葉片易受損傷，導致葉片提前衰老。POD和CAT活性則主要受光照強度影響。值得注意的是，高光照強度、高溫條件下使得POD活性升高，而高濕條件下則使得POD活性降低，即高光照強度、高溫條件時，葉片清除過氧化物能力增強，但高濕條件時則阻礙了這一清除過程。

本研究結果表明，光照強度、溫度、濕度作為主要的3個生態因子，協同調控著烤煙的成熟衰老。光照強度是影響成熟期烤煙光合作用及抗氧化活性的主要因子，溫度和濕度這2個因子影響力稍弱。成熟后期不同階段，各生態因子對烤煙的影響規律基本一致。其中光照強度和溫度因子表現為相同的影響趨勢，濕度因子在部分光合及抗氧化指標中表現出與光照強度、溫度因子不同的影響趨勢。