依達拉奉對低氧性肺動脈高壓小鼠肺組織TGF-β1及IL-6表達的影響

鄭婉，李天發，左琦，魏俊萍，顏亞妮

海南醫學院第一附屬醫院心血管內科，海南 ?？?570102

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多種臨床原因引起的肺動脈壓力異常升高的病理生理狀態[1]。低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是由于低氧引起的PAH，可導致患者右心室衰竭并最終引發死亡[2]。既往研究表明，氧化應激水平在HPH形成過程中發揮著越來越重要的作用。在HPH的早期時，肺部細胞炎性因子大量分泌，氧化應激增加，當給抗氧化應激藥物抑制后，肺動脈高壓與肺血管重塑有所改善[3]，表明氧化應激可能參與了HPH的過程，并且對肺血管的重塑有一定作用[4]。依達拉奉是一種強抗氧化劑，可防止氧化應激誘導肌萎縮側索硬化癥患者運動神經元死亡，通常被用于治療肌萎縮性脊髓側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。研究表明依達拉奉可以減弱氧化應激、抑制TLR-4/NF-κB和JAK1/STAT3炎性信號通路并增強機體抗氧化能力[5]。CAI 等[6]的研究發現，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)及白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)與低氧性肺動脈高壓相關，靶向抑制兩者可以通過調節肺動脈平滑肌細胞的增殖和凋亡改善肺動脈壓。已有研究發現，氧化應激能促進炎性因子的分泌，增加細胞凋亡水平[7-8]。然而調節氧化應激水平是否能改善低氧性肺動脈高壓小鼠體內的TGF-β1與IL-6水平進而改善肺動脈高壓，目前尚不清晰。

本研究采用依達拉奉治療低氧性肺動脈高壓小鼠，成功降低了其體內的氧化應激，并降低了TGF-β1及IL-6的表達水平，從而了解依達拉奉對于肺動脈高壓發展和治療效果的影響，為低氧性肺動脈高壓的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠(8～10 周齡，20～25 g)由維通利華實驗動物技術公司提供，許可證號為SXCK(京)2016-0011。所有小鼠處于自然光暗周期的環境中飼養，室溫25℃，實驗期間自由飲食飲水。

1.2 主要試劑 依達拉奉注射液購自陜西健民制藥有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物試劑研究所；TRIzol、逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑購自上海翌圣公司；TGF-β1抗體、IL-6 抗體、Caspase3 抗體、Bcl-2抗體購自英國Abcam公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG抗體購自Biosharp 生物科技有限公司；相關qPCR 引物由上海生工合成：GAPDH-F，5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'；GAPDH-R，5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；TGF-β1-F，5'-CGTGGAAATCAACGCT CCAC-3'；TGF-β1-R，5'-CCACGTAGTAGACGATGG C-3'；IL-6-F，5'-GCCTTCTCTGATGCT-3'；IL-6-R，5'-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3'；Bcl-2-F，5'-AGCATGCGACCTCTGTTTGA-3'；Bcl-2-R，5'-GCCA CACGTTTCTTGGCAAT-3'。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物毒性實驗 隨機數表法將同批次40只C57BL/6J小鼠分為0 mg/kg組、20 mg/kg組、40 mg/kg組、80 mg/kg 組，每組10只。每天腹腔注射依達拉奉，持續2周，每2 d觀測小鼠活動狀態并記錄體質量。

1.3.2 動物建模、分組與給藥 取C57BL/6J小鼠40 只，適應性飼養一周，隨機分為四組，每組10只，依據處理方法不同分為對照組、低氧組、正常治療組及低氧治療組。正常組和正常治療組置于正常環境飼養，而低氧組和低氧治療組的小鼠均置于氧含量10%的低氧艙，艙內二氧化碳(CO2)由CO2吸附劑清除，連續8周低氧后，通過測量小鼠肺動脈峰值流速、右心收縮壓力、右心室厚度，以確定成功構建低氧性肺動脈高壓小鼠模型后，給予藥物依達拉奉進行治療。正常治療組和低氧治療組每天腹腔注射40 mg/kg 依達拉奉，持續兩周，正常組和低氧組給予等體積生理鹽水，兩周后，收集小鼠的血清和肺組織檢測各項指標。

1.3.3 小鼠血清/肺組織中MPO、ROS、MDA的質量濃度與SOD酶活力檢測 分別取各組小鼠的血清/肺組織研磨液，根據試劑盒檢測說明書所示方法，分別檢測ROS含量、MPO、MDA和SOD的酶活性。

1.3.4 RT-qPCR 檢測各組小鼠肺組織細胞因子mRNA 的表達 TRIzol 試劑提取小鼠肺組織中的總RNA，酶標儀檢測總RNA的純度和含量。按照RT-qPCR 試劑盒實驗說明，依次進行逆轉錄和RT-qPCR 實驗。RT-qPCR反體系：上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 ng，SYBR Primix Ex TaqTM5 μL，ddH2O補充至10 μL。RT-qPCR 反應條件：95℃(30 s)預變性后，變性95℃(7 s)，退火55℃(30 s)，72℃(15 s)，40個循環周期。根據2-△△Ct法計算相對表達量。

1.3.5 Western blot檢測各組小鼠肺組織中細胞因子的表達 收集各組小鼠肺組織，使用RIPA裂解提取總蛋白，通過BCA方法進行蛋白定量。樣品變性后通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離等量蛋白轉至PVDF 膜。5%脫脂牛奶室溫條件孵育1 h，TBST洗膜5 min，3次，加入TGF-β1抗體(1∶1 000)、IL-6 抗體(1∶1 000)、Caspase3抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜8 min，3次，隨后加入HRP標記的羊抗兔的二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST 洗膜8 min，3 次。顯影曝光，利用Image-Pro Plus 圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0 和GraphPad Prism8.0軟件進行數據統計分析。計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 依達拉奉毒性實驗結果 給予小鼠注射不同濃度(0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)依達拉奉，1 次/d，持續兩周。兩周后0 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg，三組體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)；與0 mg/kg 組比較，80 mg/kg 組體質量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。結果說明，40 mg/kg 以下劑量濃度對小鼠無明顯毒性，故后續實驗選擇40 mg/kg給藥濃度。

圖1 梯度濃度依達拉奉對C57小鼠的毒性實驗

2.2 依達拉奉改善HPH 小鼠的MPO、ROS 和MDA表達水平 收集4組小鼠血清和肺組織，檢測結果顯示，與正常對照組比較，正常治療組小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量、SOD 酶活力比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常對照組比較，低氧組小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量升高，SOD 酶活力降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧治療組小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量降低，SOD 酶活力升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 依達拉奉改善低氧小鼠氧化應激

2.3 依達拉奉有效降低HPH小鼠細胞血清炎性因子因子TGF-β1、IL-6 表達 采用qRT-PCR 和Western blot檢測四組小鼠肺組織TGF-β1及IL-6表達情況，結果顯示，與正常對照組比較，正常治療組小鼠肺組織TGF-β1、IL-6 比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常對照組比較，低氧組小鼠肺組織TGF-β1、IL-6 mRNA和蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧小鼠治療組肺組織TGF-β1、IL-6 mRNA和蛋白表達降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖3和圖4。采用ELISA 檢測四組小鼠血清和肺組織TGF-β1及IL-6分泌情況。結果顯示，與正常對照組比較，正常治療組小鼠血清和肺組織TGF-β1、IL-6含量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常對照組比較，低氧組小鼠血清和肺組織TGF-β1、IL-6含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧治療組小鼠血清和肺組織TGF-β1、IL-6 含量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖3 PCR檢測各組小鼠肺組織TGF-β1和IL-6 mRNA表達

圖4 Western blot檢測各組小鼠肺組織中TGF-β1和IL-6 蛋白表達

圖5 各組小鼠血清中炎性因子TGF-β1和IL-6濃度水平

2.4 依達拉奉抑制HPH 小鼠肺組織細胞凋亡 采用qRT-PCR 和Western blot 檢測四組小鼠肺組織Caspase3及Bcl-2表達情況，結果顯示，與正常對照組比較，正常治療組小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常對照組比較，低氧組小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧治療組小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6和圖7。

圖6 PCR檢測依達拉奉對各組小鼠肺組織Caspase3和Bcl-2 mRNA表達水平

圖7 Western blot檢測依達拉奉對各組小鼠肺組織Caspase3和Bcl-2 蛋白表達水平

3 討論

HPH具有發病率高，死亡率高的特點。目前HPH的治療方法主要有：抑制肺動脈血管平滑肌細胞增殖、改善血管內皮細胞的缺氧狀態、逆轉肺動脈血管重構、抑制血管收縮因子的作用及間接促進血管擴張物質的形成等。盡管近年來針對HPH 的治療方法取得了飛速發展，但是目前只有肺移植手術才能根治HPH[9]。因此，尋找可靠的HPH治療方法仍是研究的熱點。

氧氣是維持哺乳動物生命所必需的，氧氣供應的減少(即缺氧)會改變線粒體ROS穩態并誘導內質網應激[10]。為了應對缺氧應激，細胞會發生適應性反應，這些反應主要由于缺氧誘導因子的激活、線粒體代謝的重編程、ROS 通量增加等[11]所致。缺氧引起的缺氧應激與許多疾病的病理生理有關。HAYASHI 等[12]研究發現，睡眠呼吸障礙患者會表現出間歇性缺氧，導致氧化應激增加，加速動脈粥樣硬化和肺動脈高壓。另外，暴露于低壓缺氧環境中的肺動脈平滑肌細胞的氧化應激水平增加，IL-6水平升高和炎癥細胞浸潤增加，隨后蛋白激酶ERK1/2被激活，導致肺動脈平滑肌細胞增殖并促進低壓缺氧引起的肺動脈高壓的發展[13]。本實驗中發現低氧誘導的小鼠血清和肺組織中的MPO、ROS、MDA 含量升高，SOD 酶活力降低，說明低氧性肺動脈高壓導致小鼠肺組織和外周血氧化應激水平升高。依達拉奉具有抗氧化應激和抗凋亡特性，用依達拉奉進行治療可以消除由鎘引起的小鼠氧化應激和炎癥反應[14]。之前的研究結果也表明，依達拉奉通過降低血清TNF-α水平來改善新生兒敗血癥模型中肺動脈高壓，表明依達拉奉對肺動脈高壓具有一定的治療作用。本實驗發現依達拉奉治療低氧誘導的小鼠肺動脈高壓，依達拉奉可以降低小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量，提高SOD 酶活力，表明依達拉奉對HPH 小鼠具有降低其氧化應激水平的影響。

隨著HPH研究的不斷發展，人們發現炎癥在HPH中發揮越來越重要的作用，成為了HPH關鍵病理特征之一[15]。TGF-β1是一種多功能生長因子，具有調節纖維化和免疫的特性[16]。TGF-β1被認為是炎癥性肺部疾病發病機制中的重要調節因子，在肺動脈平滑肌細胞，低氧能誘導TGF-β的上調從而介導低氧性肺動脈高壓[17]。IL-6 是常見的炎性因子，研究發現，IL-6 通過促進肺動脈平滑肌細胞的增殖參與了肺動脈高壓的肺血管重塑過程[18]。本實驗結果發現，使用依達拉奉可有效抑制HPH 小鼠組織與血清中的TGF-β1和IL-6的表達水平，表明炎性因子的水平可能受到了氧化應激水平的調節。

此外，有研究顯示氧化應激會加速細胞外基質的降解，促使細胞凋亡從而損傷血管內皮細胞[19]。LI等[20]研究發現，在缺氧條件下，肺動脈內皮細胞增殖和凋亡增加，促進肺血管重塑。本實驗研究結果表明低氧性肺動脈高壓可導致小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表達升高，即細胞凋亡增加，當給予依達拉奉治療后，可明顯改善小鼠肺組織損傷，降低其細胞凋亡水平。

綜上所述，本研究發現在低氧性肺動脈高壓小鼠體內存在較高的氧化應激水平，并且其肺組織中TGF-β1與IL-6表達增加，而使用依達拉奉抑制氧化應激后，可以顯著降低上述兩個細胞因子的水平。另外實驗發現低氧性肺動脈高壓小鼠的肺組織中的凋亡水平增加，使用依達拉奉治療后可降低肺組織細胞凋亡水平。以上實驗結果說明氧化應激可能會成為低氧性肺動脈高壓的新型治療靶點，可為進一步探索低氧性肺動脈高壓的發生機制提供了理論指導和實驗依據。