21-羥化酶缺乏癥的分子診斷及臨床意義

呂擁芬，李 嬪

上海市兒童醫院，上海交通大學醫學院附屬兒童醫院內分泌科，上海 200062

先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組常染色體隱性遺傳性疾病。其由于類固醇合成酶缺陷，導致腎上腺皮質多種類固醇激素合成不足，促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）升高，腎上腺皮質增生，孕酮等前體物質堆積而導致皮質激素缺乏及繼發高雄激素等癥候群。21-羥化酶缺乏癥（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）導致的CAH 占90%～95%［1］。21-OHD 由編碼腎上腺類固醇21-羥化酶（P450c21）的CYP21A2基因變異引起。該酶將17-羥孕酮（17-hydroxyprogesterone，17-OHP）轉化為11-脫氧皮質醇，將孕酮轉化為11-脫氧皮質酮，這些產物是皮質醇和醛固酮的前體。根據臨床表現、生化特征等，又可將21-OHD 導致的CAH 分為3 型：失鹽型（salt wasting，SW）、單純男性化型（simple virilizing，SV）和非經典型CAH（nonclassic congenital adrenal hyperplasia，NCCAH）。SW 型和SV 型CAH 因具有顯著臨床特征以及生化特點，又稱為經典型CAH。全球CAH 發病率為1/14 000～1/18 000［2］；美國非洲裔經典型CAH 發病率低得多，在不同的研究中為1/25 000～1/42 000［3］。國內報道的CAH發病率為1/16 466～1/12 200［4］。

目前，對于21-OHD 的診斷主要是通過臨床癥狀和實驗室檢測。由于該病臨床譜帶廣，實驗室檢測結果受多種因素影響，易發生誤診或漏診。以17-OHP為例，其是21-OHD 新生兒篩查的一線指標，檢測值受胎齡、出生體質量、標本采集時日齡及測定方法等因素影響，導致篩查結果有一定假陽性和假陰性率。而且，17-OHP 易受多種因素影響而波動，如應激、感染、服藥時間等，故不能單純根據17-OHP 濃度進行疾病分型。2016 年以來，《先天性腎上腺皮質增生癥21-羥化酶缺陷診治共識》《先天性腎上腺皮質增生癥新生兒篩查共識》及《新生兒先天性腎上腺皮質增生癥篩查與診斷實驗室檢測技術專家共識》等相繼發表。這些共識都提到CAH 診斷的金標準是基因檢測，并建議常規開展，尤其對于臨床上疑似而實驗室診斷困難，或診斷不明已予以糖皮質激素治療者。當其與其他疾病如21-OHD以外的CAH、先天性遺傳性腎上腺發育不良等進行鑒別時，需行基因檢測助診。在先癥者及父母基因型明確的基礎上，基因檢測可為需要再生育的CAH 家庭提供產前診斷［5］。因此，分子檢測對于21-OHD 的診斷、鑒別診斷、治療、攜帶者檢測、遺傳咨詢等具有重要意義。鑒于以上共識中均未詳細提及21-OHD 基因變異的分子基礎，本文擬總結該病分子變異的致病形式、基因型與表型相關性、基因分型對治療及遺傳咨詢的指導，以期為臨床上21-OHD分子診斷提供參考。

1 21-OHD分子變異的致病形式

21-羥化酶由功能基因CYP21A2編碼，位于染色體6p21.3，長度3.3 kb，在人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）復合體Ⅲ內；該區域基因結構復雜，在長度和拷貝數上有很大的變異性［6］。在CYP21A2基因約30 kb 處有一個非功能的假基因CYP21A1P。功能基因和假基因均含有10 個外顯子，外顯子和內含子同源性分別達98%和96%。假基因CYP21A1P因存在小插入、缺失和點突變等多個致病變異而阻止了功能蛋白的合成。在CYP21A2和CYP21A1P基因附近有其他3個基因RP1、C4、TNXB以及2 個截短的假基因RP2和TNXA，共同構成了RCCX 模塊（RP-C4-CYP21-TNX），并對應著一個高度可變的約30 kb 的DNA 序列［7］。最常見的結構形式是雙模塊，即串聯形成雙拷貝RCCX 模塊，帶有1個CYP21A1P假基因和1 個CYP21A2基因，其中基因從端粒到著絲粒的方向為RP1-C4A-CYP21A1P-TNXARP2-C4B-CYP21A2-TNXB。也存在單RCCX 模塊、三RCCX 模塊和四RCCX 模塊。大多數三RCCX 模塊攜帶2 個CYP21A1P假基因和1 個CYP21A2基因，但也可能含有2個CYP21A2基因和1個CYP21A1P假基因，并且已經在p.（Gln319*） 致病變異和CYP21A1P/CYP21A2基因嵌合的攜帶者中發現［8-9］。

由于真假基因序列的高度同源以及RCCX模塊的串聯重復，且處于重組活性很高的HLAⅢ區域，使得RCCX 模塊之間易于發生非等位基因同源重組，主要為不平衡交換和基因轉換。前者則可導致CYP21A2基因缺失、重復及形成嵌合基因，后者則導致真假基因間遺傳物質的轉換，因此CYP21A2基因變異主要包括大的基因重排變異和小的來源于假基因轉換變異，非假基因來源的自發變異所占比例很少。在21-OHD 患者中，95%的致病變異是由于真假基因間重組所致。其中，75%是由于假基因上存在的變異通過有絲分裂時微轉化事件轉移至真基因而致病［10］；20%～25%是由于減數分裂時非等位基因重組，不等交換而導致CYP21A2缺失或形成CYP21A1P/CYP21A2嵌合體。在CYP21A2基因中，只有不到5%的致病性變異不是由基因轉化引起的，可能不存在于假基因中［11］。1%～2%的變異來自CYP21A2基因的新發突變［12］。CAH也可以由單親二倍體引起，但非常罕見［13］。

2 21-OHD分子診斷策略

2.1 21-OHD基因型與表型的相關性

迄今為止，報道了21-OHD相關CYP21A2基因變異1 300余種，其中230種影響人類健康［14］。這230種致病變異中，156 種導致經典型CAH，74 種導致NCCAH。19種變異位于該基因的非編碼區，其中4種影響啟動子，包括c.-126C>T、c.-113G>A、c.-110T>C及c.-103A>G。據報道［15］，c-126C>T 引起NCCAH。230種變異中，153種是錯義突變，可導致各種形式的CAH，而無義和移碼變異通常導致經典型CAH。

最常見的變異有10種［15］，包括大片段的基因缺失和轉換、8 種CYP21A2與CYP21A1P來源的點突變（p.P30L、I2G、p.I172N、E6 cluster、p.V281L、F306+T、p.Q318X、p.R356W）、外顯子3的p.G110fs（8個堿基丟失）。這10 種變異可以解釋大部分的臨床問題。有些變異不影響蛋白質的合成，被認為是多態性。如D183E 是一種不影響酶活性的基因轉換，也存在于CYP21A1P基因中；而其他如K102R、S268T和N493S等只存在于CYP21A2基因中。

總體來說，21-OHD 基因型和表型之間有良好的相關性。如大片段的基因缺失/轉換變異、p.Q318X、p.R356W、E6 cluster、Exon3 Del8bp 及I2G 與SW 型有關，導致殘存酶活性為0～1%，這些變異為嚴重致病變異；錯義致病變異p.I172N 導致殘存酶活性為1%～2%，醛固酮合成接近正常，多與SV 型有關，為中間致病變異；第三組致病變異包括p.V281L、p.P30L、p.P453S、p.R339H、p.R369W、p.I230T 等導致殘存酶活性為20%～60%，多與NCCAH 相關，為輕度致病性變異。

由于大多數21-OHD 導致的CAH 患者是復合雜合子，經典型患者攜帶2 個嚴重致病變異的等位基因，不攜帶輕度致病變異。NCCAH 患者可能攜帶2個輕度的致病變異（25%～50%），或1 個輕度和1 個嚴重致病變異（50%～75%）。嚴重致病變異致21-羥化酶活性<1%，但輕度致病變異可有部分酶的合成，活性最高可達正常的50%。有報道顯示，在NCCAH患者中，基因型為1 種輕度的致病變異和1 種嚴重的致病變異的患者，與2 個等位基因均為輕度致病變異的患者相比，其多毛程度和17-OHP 水平（基礎值和ACTH激發值）都增高［16-17］。

盡管基因型和表型之間有相對較高的一致性，但攜帶中間致病變異的患者有可變性。例如，IVS2-13（c.293-13A/C>G）和I172N［p.（Ile173Asn）］可導致不同程度的21-羥化酶活性受損。因此，通常被認為是SV型的患者部分表現為失鹽，部分更接近NCCAH［18-19］。研究［20］顯示，P30L［p.（Pro31Leu）］與NCCAH及SV型CAH 相關。臨床表型與基因型預測一致性分別為100%（SW）、95%（SV）和70%（NCCAH）［21］。

2.2 21-OHD基因分型常用的分子診斷策略

由于CYP21A2基因拷貝數變異的頻繁出現，以及大量可能的遺傳變異，對CYP21A2等位基因的鑒定相當困難。僅采用Sanger測序無法檢出CYP21A2基因大片段缺失，而多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA） 可 檢測大片段缺失，對早期診斷和干預有重要意義，且可以通過結合探針的峰高判斷是單等位基因的缺失，還是CYP21A2基因的完全缺失，是目前CYP21A2基因缺失診斷的較為可靠的方法［22］。21-OHD最佳的基因分析應該是基于聚合酶鏈反應的序列分析聯合MLPA，有助于檢測出多種類型的變異。

由于任何檢測均有局限性及CYP21A2基因座具復雜性，這些技術都不能識別所有的變異。應該盡可能進行家系分離研究，這樣可鑒別先證者2個被檢測到的致病變異是影響2個等位基因（反式構型，trans），還是位于同一個等位基因（順式構型，cis）［23］。如為cis，盡管CYP21A2基因有2個致病變異，但只有1個等位基因發生變異而另一個等位基因正常，則無臨床表現。

3 21-OHD基因分型指導治療

基因型與表型的特定關系可直接服務于臨床診斷，為新生兒篩查及陽性患兒臨床分型提供依據；而僅通過生化激素檢測，不能預知患兒疾病的嚴重程度及確定具體的臨床分型。同時，21-OHD 基因型-臨床表型的對應關系可指導氫化可的松用藥劑量，實現更精準的治療以及預后判定。如基因型預測為SW 型，推薦使用氫化可的松聯合氟氫可的松，這樣可最大程度避免腎上腺危象，減少高鉀低鈉血癥發生，從而減少住院次數及縮短住院時間；如基因型預測為SV 型，則建議避免使用過量的氟氫可的松，以降低發生醫源性高血壓的風險。但基因型預測也存在不確定因素，尤其是中間致病變異，此時需結合臨床體征、實驗室檢測以及診療過程中的密切隨訪來指導治療。

4 21-OHD基因分型指導遺傳咨詢

21-OHD 屬于常染色體隱性遺傳性疾病，即只有當2 個等位基因同時發生變異時才會發病。如2 個等位基因存在相同的基因變異，即基因型為純合子；2個等位基因都有變異，但是在不同的位點，即為復合雜合子型。CYP21A2基因變異雖然種類繁多，但大多數患者基因型為復合雜合子型，臨床表現取決于酶活性受損較輕的等位基因［24］。

每個病例的兄弟姐妹都有25%的概率為CAH 患者，50%的概率為無癥狀攜帶者。根據1/10 000～1/20 000 的經典型CAH 發病率推算，一般人群中1/50～1/71 是雜合子，中位數為1/60，經典型CAH 的患者有1/120的概率生育患經典型CAH子代。

對于NCCAH，幾乎70%的確診患者是復合雜合子，即攜帶1個導致經典型CAH 的等位基因和1個導致NCCAH 的等位基因。2 個等位基因中，導致殘余酶活性較高的變異決定了表型。這意味著患者為NCCAH，其后代有50%的概率繼承經典的CAH等位基因。從理論上講，NCCAH 患者子代患經典型CAH的風險為1∶250［25］。然而，在2 項對NCCAH 婦女子代的回顧性研究中，其患病風險更高，為1.5%～2.5%［26］。在伴有經典型CAH 和NCCAH 的男性混合組中也發現了類似的風險［27］。

由于CYP21A2變異的高攜帶率，家庭成員可能攜帶先癥者未檢測到的CYP21A2其他變異。因此，在高危親屬中，盡管有已知的家系CYP21A2變異類型，全面篩選CYP21A2變異（通過測序和MLPA 分析）與只分析先癥者中檢測到的已知的變異類型相比更具優勢。

5 結語

分子檢測有助于21-OHD 患者的確診，尤其對于臨床疑似而實驗室診斷困難者，或診斷不明已用糖皮質激素治療者。在大多數情況下，疾病表型的嚴重程度可以通過基因型來預測。基因型與臨床表型的相關性可以為患者的短期和長期治療提供重要的指導；在先癥者及父母基因型明確的基礎上，可為需要再生育的CAH家庭提供產前診斷。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

呂擁芬和李嬪共同負責論文的撰寫和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The manuscript was drafted and revised by Lü Yongfen and LI Pin.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-11

·Accepted：2022-04-27

·Published online：2022-05-28