結膜黑色素瘤組織病理學特征、Ki-67表達和預后的關系

朱田雨，宗春燕，許詩瓊，葛盛芳，范先群，賈仁兵

1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院眼科，上海 200011；2.上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室，上海 200011

結膜黑色素瘤（conjunctival melanoma，CoM）是罕見的眼部惡性腫瘤，具有較高的死亡率。研究［1］表明，CoM 患者在初始治療后10 年的復發率、轉移率和死亡率可分別高達60%、50%和50%。因此，識別CoM預后危險因素具有重要的臨床意義［2］。

CoM 的預后目前廣泛采用美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）的第8版分期系統來評估［3］。以往的研究主要集中在臨床特征對CoM 預后的影響。近年來的研究［4-5］發現，Breslow 厚度較厚、組織學潰瘍等組織病理學特征也與腫瘤的不良預后有關。此外，Ki-67 作為腫瘤增殖活性的經典評價指標，也在腫瘤預后的判斷中具有重要價值。迄今為止，未見CoM中Ki-67指數和預后關系的研究報道［6］。鑒于此，本研究納入36 例CoM 患者，探討其組織病理學特征、Ki-67 表達在CoM 預后評估（包括局部復發、遠處轉移和疾病特異性死亡）中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2008年8月—2020年9月就診于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院眼科的36 例CoM 患者作為研究對象。納入標準：①經手術切除病變組織，組織病理學確診為CoM的患者。②臨床和組織病理學資料齊全。排除標準：①經組織病理學診斷為非CoM（例如原發性眼眶黑色素瘤、淚囊黑色素瘤等）的患者。②隨訪時間過短（<6個月）。③資料收集不完整。

36例患者中，有18例（50.0%）接受局部腫瘤切除術輔以冰凍治療，其中2 例接受了局部化學治療；另外18例患者（50.0%）接受了眶內容物剜除術，其中6 例輔以放射治療。發生淋巴結轉移的患者中有11例（30.6%）接受了頸部淋巴結清掃術。

1.2 資料收集

收集患者的臨床資料和組織病理學信息。臨床資料包括性別、年齡、眼別、診斷日期、發病部位（累及淚阜、穹窿、瞼結膜、眼眶），以及初次來我院就診時是否復發（復發時間）、轉移（轉移時間、轉移部位、局部或遠處轉移）等。對手術切除的組織標本切片行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E 染色），讀取組織病理學特征，包括Breslow 厚度、組織學潰瘍、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrated lymphocytes，TILs）、組織學消退、有絲分裂率、外周神經侵犯、血管浸潤、垂直生長期、微衛星灶和組織學類型；并將Ki-67 的免疫組織化學染色結果進行記錄。所有患者的病理H-E染色切片均經我院病理科會診、復核，且由2 位經驗豐富的病理科醫師進行獨立閱片和評估。

1.3 病理學特征判定

判定標準［5，7-8］如下。組織學潰瘍的定義是在無外傷或近期手術的情況下，周圍上皮變薄、消失或出現反應性增生，上皮缺損，纖維蛋白沉積和中性粒細胞浸潤。組織學消退現象的特征是腫瘤細胞被淋巴細胞取代，以及上皮細胞的衰減和纖維化與炎癥細胞、噬黑色素細胞浸潤和毛細血管擴張。有絲分裂率的讀取方法是：首先是在基質或結膜下層組織中找到有絲分裂像最多的區域，在計算初始區域的有絲分裂數后，擴展到相鄰的非重疊區域，直到評估對應于1 mm2的組織區域。TILs是包圍和破壞侵襲性腫瘤細胞的淋巴細胞，可分為“活躍”“不活躍”和“不存在”3 種狀態。TILs 為“活躍”狀態表示整個瘤床內彌漫著淋巴細胞浸潤；“不活躍”指僅局灶區域有TILs；“不存在”為瘤床內無TILs。顯微鏡下的微衛星灶是指在觀察到的毗鄰但不連續或深至原發腫瘤部位的灶轉移。Ki-67 指數是指核染色陽性的腫瘤細胞總數占所有腫瘤細胞總數的百分比，染色陽性表現為細胞核上出現棕紅色顆粒。每張切片選取5 個不同視野，每個視野計數100 個細胞，分別記錄每個視野中陽性細胞個數及腫瘤細胞個數，各自取平均值作為陽性細胞總數和腫瘤細胞總數。

1.4 統計學方法

使用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。不符合正態分布的定量資料包括Breslow 厚度和有絲分裂率，用M（Min～Max）表示。定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗進行分析。使用二元Logistic 模型確定預后危險因素，用95%置信區間（confidence interval，CI）的比值比（odds ratio，OR）和風險比（hazard ratio，HR）描述危險因素的影響。相關性分析采用Spearman等級相關。利用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，并通過對數秩檢驗（log rank test）進行比較，Z 檢驗法用于比較Ki-67 指數≤20%和>20%患者的3年無復發生存率。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床及組織病理學特征

36例CoM患者中男性26例（72.2%），女性10例（27.8%）。所有患者皆為單眼發病。平均年齡57.81（31～82）歲，平均隨訪時間40.15（8～146）個月。發病位于淚阜11 例（30.6%）、穹窿8 例（22.2%）、瞼結膜15 例（41.7%）。CoM 瘤體Breslow 厚度為4.05（0.2～15.9）mm，有絲分裂率為7（0～35）/mm2。患者其他的臨床與組織病理學特征情況如表1所示。35例（97.2%）處于垂直生長期，而僅有1例（2.8%）觀察到顯微鏡下微衛星灶。

表1 CoM患者臨床及組織病理學特征Tab 1 Characteristics and histopathological features of CoM patients

2.2 組織病理學因素與預后的關系

二元Logistic回歸分析結果顯示（表2），Breslow厚度較厚提示CoM 局部復發風險較高（P=0.017）。具體而言，Breslow 厚度>4 mm 提示局部復發風險（P=0.049）和疾病特異性死亡風險（P=0.049）更高。組織學潰瘍也提示局部復發風險較高（P=0.030）。此外，組織學消退現象與遠處轉移風險增加相關（P=0.046）。

表2 二元Logistic分析組織病理學因素與預后的關系Tab 2 Binary Logistic regression analysis of the relationship between histopathological factors and prognosis

2.3 Ki-67指數與組織病理學因素和預后的關系

Ki-67 指數與Breslow 厚度、組織學潰瘍、TILs、消退現象、外周神經侵犯和血管浸潤均無關，與區域淋巴結轉移、遠處轉移和疾病特異性死亡等預后因素無關，與局部復發相關（P=0.016，表3）。對Ki-67指數（>20%或≤20%）、Breslow 厚度（>4 mm 或≤4 mm）、潰瘍有無、TILs有無、組織學消退有無、外周神經侵犯有無、血管浸潤有無、局部復發、遠處轉移、疾病特異性死亡和臨床T分期之間進行Spearman相關分析。相關系數r值顯示于各圖塊中，絕對值大小表示相關性程度。結果發現，Ki-67 指數與局部復發呈顯著正相關（r=0.433，圖1）。

圖1 各組織病理學因素與預后的相關性熱圖Fig 1 Heat map of the correlation between histopathological factors and prognosis

表3 Ki-67指數與組織病理學因素及預后的關系Tab 3 Correlation of Ki-67 index with histopathological factors and prognosis

Continued Tab

2.4 Ki-67指數與復發風險相關

Kaplan-Meier 生存曲線（圖2）顯示，Ki-67 指數>20%的患者復發風險顯著升高［HR=3.61；95%CI（1.26～10.28）；Log rankP=0.011］。Ki-67 指數≤20%的患者3 年無復發生存率為63.8%，而Ki-67 指數>20%的患者3年無復發生存率顯著降低，僅為21.4%，2組差異具有統計學意義（P=0.028）。

圖2 Ki-67≤20%和>20%的無復發生存曲線分析Fig 2 Analysis of recurrence-free survival curve of Ki-67≤20%and>20%

3 討論

CoM 產生于結膜上皮基底層的非典型黑色素細胞，可由原發性獲得性黑變病（primary acquired melanosis，PAM）或色素痣惡變而來，或表現為原發病變［9］，約占眼部腫瘤的5%［10］。原位CoM 的一線治療是局部手術切除輔以局部治療［11-12］，但目前沒有轉移性CoM 的標準治療方案。鑒于CoM 和皮膚黑色素瘤在分子和病理背景上的相似性，用于治療轉移性皮膚黑色素瘤的靶向藥物可能對轉移性CoM 有益［13］。然而，患者即使進行積極治療，在初始治療后10 年復發率、轉移率和死亡率仍居高不下［1］。因此，探究CoM 預后危險因素，對改進治療方案具有重要意義。

本研究中，患者發病部位包括淚阜、穹窿、瞼結膜，其中以瞼結膜受累最常見（15 例，41.7%）。根據AJCC 第8 版臨床T 分期系統，12 例患者（33.3%）為T2 期，23 例患者（63.9%）為T3 期，說明大部分患者就診時已處于較晚期階段。

組織病理學特征方面，Breslow 厚度中位數為4.05 mm，其中18 例患者（50.0%） Breslow 厚度>4 mm，提示該隊列的整體Breslow 厚度較厚，可能與患者處于較晚期階段有關。組織學潰瘍出現在13 例患者（36.1%）中。Breslow 厚度和潰瘍是AJCC 第8版病理T分期系統的重要評判指標。作為黑色素瘤中最重要的組織病理學因素，Breslow 厚度和潰瘍在皮膚黑色素瘤中被認為與不良預后相關。ESMAELI等［4］發現，Breslow 厚度和潰瘍與CoM 的區域淋巴結轉移、遠處轉移和疾病相關死亡風險增加有關，強調應把潰瘍納入界定T1 和T2 期的CoM 分期標準。JIA 等［8］也指出，CoM 中Breslow 厚度較厚或有組織學潰瘍的患者有更高的遠處轉移風險。本研究發現，Breslow 厚度與CoM 局部復發和疾病相關死亡風險呈正相關，組織學潰瘍是局部復發的危險因素。這與文獻報道一致，即Breslow 厚度較厚和組織學潰瘍與CoM不良預后相關。

有絲分裂率是腫瘤增殖的重要指標，以每平方毫米區域內有絲分裂數來衡量。在皮膚黑色素瘤AJCC 第7 版分期系統中，也曾使用有絲分裂率來確定T1 期皮膚黑色素瘤的轉移高危程度［14］。在多項研究［15-16］中，有絲分裂率被認為是皮膚黑色素瘤中一個顯著的不利因素。本組病例的有絲分裂率中位數為7/mm2。盡管分析發現，有絲分裂率與局部復發、遠處轉移和疾病相關死亡均無顯著相關性，但有絲分裂率在CoM 中的預后價值仍有待進一步探究。

TILs 是包圍和破壞侵襲性腫瘤細胞的淋巴細胞，被分為“活躍”“不活躍”和“不存在”3 種狀態［7］。本研究中共有4 例患者（11.1%）TILs 處于“活躍”狀態，26 例（72.2%）處于“不活躍”狀態，僅有6例CoM患者不存在TILs，與ESMAELI等［4］的研究結果類似；在該研究中，TILs 有4 例（5%）判定為“活躍”，61例（69%）為“不活躍”，其余為“未知”狀態，即大多數（74%）CoM 病例也存在TILs，提示CoM與抗腫瘤免疫的激活可能有一定相關性。

針對皮膚黑色素瘤的研究［17］表明，組織學消退與較高的復發、轉移和死亡風險有關；但也有研究［18-19］認為，消退是有利的預后因素或與結局無關。本研究中，7例CoM 患者出現組織學消退，并與遠處轉移相關。消退的組織學特征是黑色素瘤細胞減少，反映了宿主的免疫反應，包括炎癥浸潤、黑色素吞噬和毛細血管擴張等［7］。BASTIAN 等［20］認為，盡管消退期間的免疫細胞浸潤能夠清除黑色素瘤細胞，但它也可能導致抗原變異，并觸發免疫逃逸機制。這也解釋了為什么在我們的研究中，消退現象是一個不利的預后因素。

Ki-67 是一種增殖細胞的相關核抗原，在細胞周期S、G1、G2和M 期均有表達（G0期缺如），是反映腫瘤細胞增殖活性的可靠指標［21］。我們發現Ki-67指數>20% 與CoM 更高的局部復發風險相關，與JAKOBIEC 等［22］研究結果相似。Ki-67 指數被證明有助于區分結膜黑色素痣和CoM，結膜黑色素痣中Ki-67 指數的平均值為1.89%，顯著低于CoM 的17.3%［22］。本研究中Ki-67 指數與遠處轉移和疾病相關死亡風險無關，提示Ki-67 可作為一個早期的預后評價指標，指導臨床工作中對Ki-67 指數較高的患者進行密切隨訪，及時監測患者病情，減少局部復發的發生。

本研究的不足之處在于病例數量限制，尚缺乏有力的統計學證據，因此仍需擴大隊列深入探究。綜上所述，本研究對36 例CoM 的臨床和病理資料進行總結，分析了預后風險因素。Breslow厚度較厚、潰瘍、消退現象和Ki-67>20%提示CoM 預后不良。CoM 復發率、轉移率和死亡率較高，因此準確分期并結合病理學特征對患者預后做出判斷，有助于治療方案的選擇和優化。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究遵守《赫爾辛基宣言》的宗旨，并經上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院研究倫理委員會批準（SH9H-2019-T185-2）。研究對象或其親屬已經簽署知情同意書。

This study was conducted in accordance withDeclaration of Helsinki， and was reviewed and approved by The Ethics Committee of the Ninth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （SH9H-2019-T185-2）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

朱田雨、宗春燕參與了臨床及病理學資料的收集和統計工作；朱田雨、許詩瓊、賈仁兵參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The characteristics and histopathological data and statistics work was done by ZHU Tianyu and ZONG Chunyan. The manuscript was drafted and revised by ZHU Tianyu， XU Shiqiong and JIA Renbing.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-19

·Accepted：2022-05-25

·Published online：2022-05-28