綏芬河河蟹種質遺傳多樣性參數優化

王世會，羅亮，張瑞，郭坤，徐偉，張旭彬，趙志剛

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所黑龍江省冷水性魚類種質資源及增養殖重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.中國水產科學研究院鹽堿水域漁業工程技術研究中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150070；3.黑龍江省水產技術推廣總站，黑龍江 哈爾濱 150010）

河蟹即絨螯蟹（Eriocheir）是我國重要的水產經濟蟹類之一[1]。根據現有文獻報道，河蟹包括中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、合浦絨螯蟹（Eriocheir hepuensis）和日本絨螯蟹（Eriocheir japonicus）三個有效種[2-4]。河蟹在我國分布范圍較廣，北到黑龍江省綏芬河流域，南至廣西壯族自治區南流江流域均有野生河蟹的自然分布。從20 世紀末到21 世紀初，隨著我國養殖河蟹產量逐年增長，對河蟹良種的需求量也逐年增加。截至2021 年4 月，我國共培育了“光合1 號”[5]、“長江1 號”[5]、“長江2 號”[6]、“江海21”[7]和“諾亞1 號”[8]五個國家級河蟹新品種。雖然河蟹良種數量逐漸增多，但良種覆蓋率并不高。除了要加大現有河蟹良種的推廣力度外，開發新的河蟹種質也是重要的途徑之一。

隨著種質資源調查及相關科研工作開展，越來越多的河蟹種質得到證實[9-13]，其中綏芬河河蟹個體大而廣受關注[14]。2003 年黑龍江省水產技術推廣總站率先開展了“綏芬河河蟹人工繁育及養殖技術研究”的科技攻關，培育出大眼幼體80 kg，約1 400萬只[14]。2020 年9 月調研表明，黑龍江省綏芬河天然水域河蟹雌體成蟹平均規格為（103.73±2.26）g，其中≥100 g 個體占比為46.39%；雄體成蟹平均規格為（148.63±7.27）g，其中≥150 g 個體占比為46.16%。這些數據說明，綏芬河河蟹規格差異較大，且大規格河蟹比例較高。同年秋季調研黑龍江省稻田養殖遼河水系河蟹的生長情況，發現雌體成蟹平均規格僅為60 g 左右，雄體成蟹平均規格僅為103 g 左右。雖然池塘養殖模式河蟹規格有所提高，但與黑龍江省土著綏芬河河蟹種質相比而言，其平均規格差異仍然較大。因此，系統評價綏芬河河蟹種質資源，分析其群體遺傳多樣性，對我省土著河蟹的種質開發利用及產業發展具有非常重要的現實意義。

目前開發利用的河蟹微衛星分子標記，均以中華絨螯蟹為對象。而綏芬河河蟹種質的分類地位目前存在一定爭議。綏芬河在中國境內流經東寧市后，隨后進入俄羅斯境內，在流經185 km 后注入阿穆爾灣，進入日本海。因為河蟹具有洄游生殖習性，需要海水完成交配繁殖過程，所以綏芬河河蟹被普遍認為是從日本海溯游到中國境內的符拉迪沃斯托克河蟹，即日本絨螯蟹[13]。趙乃剛等[15]研究發現：俄羅斯符拉迪沃斯托克的河蟹表型處于中華絨螯蟹和日本絨螯蟹之間，但更接近于日本絨螯蟹。王武等[16]證實，綏芬河河蟹能夠與遼河水系中華絨螯蟹雜交，雜后代可以完成繁育，說明兩者之間不存在生殖隔離。隨后XU 等[4,17]證實綏芬河河蟹為中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的分布混雜區，但姜曉東[13]通過地標點法表明，綏芬河河蟹應屬于中華絨螯蟹，而非日本絨螯蟹。雖然綏芬河河蟹的分類地位有待商榷，但種質遺傳多樣性分析的前提是要先確定河蟹樣本數量、多態性位點數量以及性比等關鍵參數。本研究通過探究影響綏芬河河蟹種質遺傳多樣性的關鍵參數，以期為綏芬河河蟹遺傳多樣性分析及種質開發利用提供基礎數據支撐。。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020 年9 月，在黑龍江省東寧市綏芬河流域（131.18°E，44.07°N）采用地籠捕捉野生河蟹60 只（♀∶♂=1∶1），體質量在100～150 g 之間，冷鏈活體運輸至黑龍江水產研究所，取其附肢肌肉保存于-80℃冰箱中。

1.2 DNA 提取

采用天根生化科技（北京）有限公司生產的磁珠法動物組織基因組DNA 提取試劑盒（DP341-2，）提取綏芬河河蟹肌肉組織的DNA，隨后1.5%瓊脂糖電泳檢測DNA 的完整性。DNA 樣品稀釋至50 ng/μL，-20℃貯存備用。

1.3 引物篩選及PCR 擴增

從已報道[18-22]的河蟹微衛星引物中篩選出20對多態性較高的引物應用于本實驗。引物位點特征信息如表1 所示。所有正向引物（5' 端）采用FAM或HEX 熒光標記，所有反向引物采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的常規引物。PCR 反應體系為20 μL，包括1 μL DNA 模板稀釋液、0.5 μL正向引物、0.5 μL 反向引物、2×Es Taq Master Mix（Dye）（CW0690，康為世紀生物科技有限公司生產）和8 μL ddH2O。PCR 反應程序為：94℃預變性2 min，隨后共進行35 個循環，包括94℃變性30 s，根據每個引物適宜的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸10 min。取少量PCR 產物3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認目的條帶后，其余PCR 產物置于-20℃貯存備用。將2 個不同熒光標記（1 個FAM標記和1 個HEX 標記）的PCR 產物合并。將混合后的產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司毛細管電泳檢測，根據分子標記重復序列數和擴增片段堿基數范圍，修正目的片段長度，將目的條帶數值導入Microsoft Excel 中分析備用[10]。

表1 河蟹微衛星引物位點特征Tab.1 Characterization of microsatellite loci in mitten handed crab

1.4 數據分析

根據各位點基因片段長度，確定每個樣品各位點的基因型。利用Popgen 1.32 軟件分析遺傳多樣性參數信息，包括等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、香農威納指數（I）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）[23]；采用PIC_Calc 6.0 軟件計算多態性信息含量（PIC）[24]。

本實驗探究了不同樣本量、位點數和性別比對遺傳多樣性參數的影響。（1）不同樣本數量對遺傳多樣性參數的影響分為6 組（60 樣本組、50 樣本組、40 樣本組、30 樣本組、20 樣本組和10 樣本組），每個樣本組采用的位點數量均為20 個，雌雄性別比均為1∶1；（2）不同位點數量遺傳多樣性參數影響共分為4 組（20 位點、15 位點、10 位點和5 位點），所用樣本數量為60 只，雌雄性別比為1∶1；（3）不同性別比對遺傳多樣性參數影響分為5 組：全部雌體、雌雄比2∶1、1∶1 和1∶2 及全部雄體，所用樣本數量為30 只，位點數量為20 個。

所有數據采用平均值±標準誤（Mean±SE）表示，應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，采用ANOVA 進行方差分析，Duncan 氏法多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同樣本數量遺傳多樣性參數比較

不同樣本數量各位點等位基因數量如圖1 所示。整體而言，隨著樣本數量減少，每個位點的Na值也呈下降趨勢，其中20 和10 樣本組的Na值下降明顯。等位基因數越多的位點，Na值下降幅度越大。60 樣本組Eril 3 位點的Na值最高，達到了26 個；Eril 1 位點的Na值最低，為7 個。10 樣本組Eril 16和Esin18 位點的Na值最高，均為12 個，而Eril 12位點的Na值最低，僅為3 個。不同樣本數量蟹各位點有效等位基因數量除Eril 1 和Eril 2 位點外，其余10 樣本組各位點的Ne值均最低，從60 樣本組到10 樣本組的Ne值整體上呈下降趨勢。60 樣本組Eril 3 位點的Ne值最高，達16.5 個；Eril 5 位點的Ne值最低，僅2.4 個。10 樣本組Scaffold242247_151216 位點Ne值最低，僅1.7 個（圖2）。

圖1 不同樣本數量各位點等位基因數量Fig.1 The number of alleles in different individual numbers

圖2 不同樣本數量各位點有效等位基因數量Fig.2 The number of effective alleles at each locus in different sample individual number groups

各位點觀測雜合度隨著樣本量的減少，除位點Eril 3、Eril 10、Eril 13 和Eril 16 的Ho值相差不大外，其余位點Ho值均變化明顯（圖3）。10 樣本組樣本量太少，明顯影響數據的真實度。

各位點期望雜合度數值變化情況，除Eril 1、Eril 2、Eril 5、Eril 12 和Scaffold256287_157596 位點He值隨樣本量變化較大外，其余位點He值隨樣本量變化不大（圖3）。10 樣本組Eril 12 位點He值較60 樣本組下降了27.8%。

圖3 不同樣本數量各位點觀測雜合度Fig.3 The number of observed heterozygosity at each locus in different sample individual number groups

圖4 不同樣本數量各位點期望雜合度Fig.4 The number of expected heterozygosity at each locus in different sample individual number groups

各位點多態性信息含量變化情況，絕大部分位點隨樣本量變化不大，僅20 和10 樣本組的Eril 5、Eril 12 和Scaffold256287_157596 位點PIC 值變化較大，其中10 樣本組Eril 12 位點PIC 值較60 樣本組下降幅度最大，約40%（圖5）。

圖5 不同樣本數量各位點多態性信息含量Fig.5 The polymorphism information content at each locus in different sample individual number groups

各位點香農威納指數隨著樣本量的變化，I 值變化明顯。其中10 樣本量組與其它樣本量組差異較大。其中Eril 12 位點I 值較60 樣本組下降了51.04%，說明10 樣本組的樣本量太少，顯著影響了整體數據的真實度（圖6）。

圖6 不同樣本數量各位點香農威納指數Fig.6 The Shannon Wiener Index at each locus in different sample individual number groups

不同樣本數量20 個位點的平均遺傳多樣性參數，60 樣本組與30～50 樣本組、20 樣本組和10 樣本組平均Na值存在顯著性差異（圖7-a）（P＜0.05），30～50 樣本組內平均Na值無顯著性差異（圖7-a）（P＞0.05）。50～60 樣本組與20～40 樣本組、10 樣本組的平均Ne值存在顯著性差異（圖7-a）（P＜0.05），50～60 樣本組內、20～40 樣本組內平均Ne值則無顯著性差異（圖7-a）（P＞0.05）。不同個體數的平均Ho值、He值和PIC 值則無顯著性差異（圖7-b）（P＞0.05）。30～60 樣本組與20 樣本組、10 樣本組I值存在顯著性差異（圖7-b）（P＜0.05）。

圖7 不同樣本數量遺傳多樣性參數比較Fig.7 Comparison of genetic diversity parameters in different sample individual number groups

2.2 不同位點數量遺傳多樣性參數比較

60 個樣本量不同位點數量的遺傳多樣性參數如圖8 所示。不同位點數的平均Na、Ne、Ho、He、PIC和I 均無顯著性差異（P＞0.05）。由20 位點到15 位點的遺傳多樣性參數值差別不大，而5 位點的參數下降較為明顯，標準誤值明顯增大。說明位點數少會影響群體遺傳多樣性評價的準確性。

圖8 不同位點數量遺傳多樣性參數比較Fig.8 Comparison of genetic diversity parameters in different premier loci in different sample individual number groups

2.3 不同性別比遺傳多樣性參數比較

30 樣本量不同性別比的遺傳多樣性參數如圖9 所示。不論哪種性別組合，不同位點數的平均Na、Ne、Ho、He、PIC 和I 均無顯著性差異（P＞0.05），說明雌雄性別比對群體遺傳多樣性分析無顯著影響。

3 討論

遺傳多樣性是評價物種資源狀況的重要依據和從本質上揭示物種起源、變異和進化的重要手段[25]。遺傳多樣性參數包括等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態性信息含量（PIC）和香農威納指數（I）等[12]，與基因豐度呈正相關[26]。

本研究表明：不同樣本數量綏芬河河蟹Na值差異較大，主要原因是Na嚴重依賴于樣本量的大小，大樣本量包含更多的等位基因[27]。針對同一位點Esin18 而言，遼河、黃河和長江水系野生與養殖中華絨螯蟹共360 個樣本的Na為34 個[10]，長江水系中華絨螯蟹早熟與晚熟品系共480 個樣本的Na為52 個[28]，長江、甌江、閩江和南流江水系野生河蟹共128 個樣本的Na為39 個[12]。而本研究綏芬河河蟹共60 個樣本的Na為23 個，明顯低于已往文獻報道數值，主要原因有三點：一是本研究樣本量為60個，而上述相關研究的樣本量顯著多于本研究的樣本量；二是綏芬河河蟹為單一地理群體，而上述相關研究為多地理群體，多地理群體會增加基因豐富度；三是本研究所用位點為針對中華絨螯蟹開發的分子標記，對綏芬河河蟹種質可能存在一定的不適性。因此本研究Na值會較低。其余位點如Esin42、Esin67、Scaffold256287_157596、Scafold16450_13154、Scaffold387247_202848、Scaffold101834_74240、Scaf fold242247_151216、Scaffold306931_218734 等Na值與已往報道文獻[10,12,28]數值的差異原因同上。本研究中不同樣本量每個位點的Ne值均小于Na值，可能是等位基因在不同樣本量中分布不均勻、等位基因頻率分布不均所致[29]。

本研究中，不同樣本數量綏芬河河蟹Ho差異較大，主要原因是Ho很容易受到樣本量的影響[30]。He受樣本數量影響相對較小，本研究中僅20%位點受到樣本量影響，其余80%位點則相對較為穩定，這與阮惠婷等[30]在飄魚（Pseudolaubuca sinensis）中的研究結果相似，因此He可以作為遺傳多樣性分析的重要參數，He數值越大，表明遺傳多樣性越高。PIC 是反應群體的遺傳變異和等位基因位點多樣性的重要指標[31]。當PIC≥0.5 時，為高度多態位點；0.25＜PIC＜0.5 時為中度多態位點；PIC≤0.25 時為低度多態位點。本研究中僅20 和10 樣本量Eril 5、Eril 12 和Scaffold256287_157596 位點PIC 值變化較大，且數值均大于0.5，說明綏芬河河蟹天然群體遺傳多樣性很高，但樣本量較少會影響PIC 數值的精確性。I 是反應群體均勻性分布的一個重要指標，一般情況下I 值介于1.5～3.0 之間[32]。本研究中10樣本量95%位點I 值明顯低于20～60 樣本量I 值，說明I 值受低樣本量影響較大。而超過20 樣本量后，I 值受樣本量差異影響較小。

現有文獻報道，影響河蟹遺傳多樣性參數的位點數從6[33,34]到30 個[28]不等。本研究中20、15、10 和5 位點四種情況對遺傳多樣性參數的影響結果表明：5 位點對Ne、Ho、He、PIC 和I 值影響較大，且標準誤數值偏大。這與目前無文章采用5 位點分析河蟹群體遺傳多樣性相一致[12,34,35]。Wang 等[12]采用30 只樣本量，8 個多態性位點分析長江、甌江、閩江和南流江水系野生河蟹群體顯示，Ne分別為10.266、9.969、9.491 和7.308；熊良偉等[18]采用30 只樣本量，10 個多態性位點分析遼寧養殖、江蘇養殖和長江野生群體的遺傳多樣性參數，表明每個群體的Ne分別為8.710、8.770 和9.030；劉青等[10]采用60 只樣本量，29 個多態性位點分析遼河、黃河和長江水系野生與養殖中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性參數，表明每個群體的Ne值分別為13.080、13.757、14.099、13.550、14.006 和14.078；Li 等[28]采用60 只樣本量，30 個多態性位點分析長江水系中華絨螯蟹早熟品系表明,不同選育世代（G0-G3）的Ne分別為16.729、13.391、15.038 和14.981，晚熟品系（G0-G3）的N 分別為16.591、14.775、13.236 和14.942。在檢索河蟹群體遺傳多樣性相關文獻時，發現一般樣本量較多的文獻，其應用的位點數也較多，而Ne值受樣本量、檢測群體等多因素影響，因此，單純依靠現有文獻報道無法確定最小的位點數目。而本研究表明，60 只樣本量，20、15、10 和5 位點的Ne分別為8.870、9.464、8.432 和7.836，標準誤分別為0.971、1.214、1.512 和2.989。相同群體樣本量可以精確不同位點數量對遺傳多樣性參數的影響數據。不同性別比對河蟹遺傳多樣性參數影響目前暫無文獻報道。本研究表明，性別比對遺傳多樣性參數無顯著性影響，故在實驗期間性別比對遺傳多樣性參數的影響可以忽略不計。

綜上所述，不同樣本量對綏芬河河蟹各位點遺傳多樣性參數Na、Ne和Ho影響較大，且10 樣本量降低了參數PIC 和I 數值。5 位點明顯降低參數Ne、Ho、He、PIC 和I 數值，性別比對參數無顯著影響。