石山口水庫水體微生物多樣性研究

林偉，趙良杰，楊治國

（信陽農林學院水產學院，河南 信陽 464000）

石山口水庫坐落于河南省信陽市東南地區，水庫最大容量為3.7×109m3，流域面積約306 km2，是以灌溉為主，保證防洪、結合發電、以及養殖的丘陵型水庫。水源以靈山沖河道水為主，年平均徑流量1.392×109m3，年輸出水量0.8×109m3，年平均降水量約為1 120 mm。水庫岸線曲折，支流眾多，沿庫有6 個鄉、36 個行政村的農田、山林。庫區周圍土地利用以茶園、林地、耕地、居民用地為主[1]。石山口水庫水體平均深度在9.3 m 左右，利于濾食性魚類花鰱（Aristichthys nobilis）、白 鰱（Hypophthalmichthys molitrix）生長。石山口水庫被私人承包多年，以前有肥水養魚的情況，水體富營養化比較嚴重。近年來，城市化和工業化的飛速發展，人類活動、農業、重工業等產生的垃圾，使得各地的河流、水庫等均受到了不同程度的污染，有機物富集并滋生大量微生物。微生物是湖泊水生態系統中的初級生產者，一般個體小、數量多、繁殖速度快、分布范圍廣等，在水體有機質的分解、污染物降解、生態系統修復方面均具有重要的作用。微生物對水體環境因素的變化極其敏感，所以微生物的群落組成與多樣性常常被用來反映水環境的變化。因此微生物數量、組成、多樣性等指標常被用作評價水質的重要生物指標。

微生物可以作為環境現狀指示生物，還可以反過來影響外界水環境，修復河流水體生態，因此，研究微生物群落結構特征具有重要意義[2]。研究微生物多樣性的傳統方法主要是分離培養方法。該方法研究時間長，很多微生物沒有有效的培養方法，無法進行系統研究。宏基因組測序技術已極為成熟，可以快速分析樣品中所有微生物的種類及豐度。采用宏基因組方法研究石山口水庫水體微生物多樣性，為確定石山口水庫水質的優劣，對水體的治理和漁業養殖模式提供了一系列的數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域與樣品采集

根據《水質采樣方案設計技術規定》的斷面設置原則，在石山口水庫的上、中、下游選取流急、適中和緩慢處設三個采樣區，7 個樣品點（圖1）；在水庫兩支流處分別設置1#和2#兩個采樣點，壩前設置3#采樣點。2017 年5 月中旬采樣，1#、2#采樣點深度均為0 m、3 m，分別記作ssk1.0 m、ssk1.3 m、ssk2.0 m、ssk2.3 m，3#采樣點深度分別為0 m、4 m 和8 m，分別記作ssk3.0 m、ssk3.4 m、ssk3.8 m，共計7 個水樣。

圖1 石山口水庫采樣點分布Fig.1 Distribution of water sampling sites in Shishankou

1.2 方法

通過Illumina 平臺對樣品進行高通量測序，實驗流程分為：基因組DNA 的抽提、PCR 擴增、熒光定量、構建Miseq 文庫和Miseq 測序[3]。

1.2.1 基因組DNA 的抽提

采用Power Soil DNA Kit（Mo Bio Laboratories，Carlsbad，California，美國）提取樣品中的總DNA。量取一定量的水體樣品，按照說明書進行DNA 提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的總DNA，并核對基因組DNA 的濃度與完整性[4]。

1.2.2 PCR 產物擴增

以提取水樣的總DNA 為模板，采用細菌通用引物：正向27F:（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和反向引物1492R:（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），擴增細菌16S rDNA 序列。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，然后用離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR 產物[5]。

1.2.3 熒光定量標記

參照電泳初步定量結果，將PCR 產物通過熒光染料或熒光標記的特異性探針進行檢測定量，之后每個樣品按照特定的測序量要求進行相應比例的混合。

1.2.4 構建Miseq 文庫

對上面經過熒光定量標記過的樣品處理，使樣品之間連接成“Y”字形接頭；然后通過磁珠篩選，去除接頭自連片段；先對篩選后的樣品進行PCR 擴增，然后進行Miseq 文庫模板的富集；最終由于氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA 片段[6]。

1.2.5 Miseq 測序

取一段16S rRNA 基因片段為引物，用PCR 儀對采取的基因片段進行擴增[7]。

按照每個樣品的特定測序量要求，檢測定量擴增基因，然后根據特定比例混合，對原始序列初步處理，進行OTU 聚類（97%相似性可認定為同一個種，初步認為一個OTU 都是屬于一個種的微生物），選取高質量的序列進行分析[8]。

1.3 數據分析

將上面分析出來的數據繪制成Excel 表格，之后分別計算出相應的Chao 指數、ACE 指數、Shannon 指數和Simpson 指數。在以上基礎上運用IBM SPSS Statistics 22 軟件對這些數據進行物種組成的聚類分析和主成分分析（PCA）等統計比較分析[9]。

（1）ACE 指數：用來估計群落中含有的OTU 數目的指數。

（2）Chao 指數：在生態學中一般用來評估物種的總數。

（3）Shannon 指數：即香農指數，一般用來表示樣本的微生物多樣性。

H'=-ΣPi1nPi，式中:Pi為物種i 的個體數占總個體數的比例，i=1,2,...,S。

（4）Simpson 指數：即辛普森指數，一般用來表示樣本的微生物多樣性和均勻度。

D=1-ΣPi2，式中:Pi為物種i 的個體數占總個體數的比例，i=1,2,...,S。

2 結果與分析

2.1 微生物群落多樣性指數分析

利用Illumina 公司線上分析平臺分析3 個采樣點水樣中的微生物多樣性指數，包括：分類單元數、Chao 指數、ACE 指數、香農指數（Shannon index）和辛普森指數（Simpson index）等[10]（表1，圖2～圖4）。水體中分類單元數介于547～666 之間，Chao 指數介于615.4789～731.6557，ACE指數介于614.5390～726.0438，說明樣品豐度較大。香農指數介于5.018～5.167 之間，說明樣品的多樣性較高，物種豐富。辛普森指數介于0.0119～0.0191 之間，說明樣品的均勻度較差。

表1 石山口水庫水中微生物多樣性指數分析Tab.1 Analysis of microbial diversity indices in water in Shishankou Reservoir

圖2 石山口水庫微生物分類單元數、Chao 指數、ACE 指數分析Fig.2 Analysis of the number of microbial taxa,Chao index and ACE index in Shishankou Reservoir

圖3 石山口水庫微生物Shannon 指數分析Fig.3 Analysis of microbial Shannon index of in Shishankou Reservoir

圖4 石山口水庫微生物Simpson 指數分析Fig.4 Analysis of microbial Simpson index in Shishankou Reservoir

2.2 微生物群落組成

由圖5 可知，石山口水庫水中有50%～70%左右未被鑒定出來的微生物種群，在已知的微生物種群中優勢種有：念珠菌（Candidatus-Pelagibacter,12.10%～17.50%）、硫單胞菌屬（Thiomonas,0.69%～1.21%）、軍團桿菌屬（Legionella,0.55%～0.87%）、擬桿菌門（Terrimonas,0.42%～0.93%）、桿菌（Paucimonas,0.50%～0.83%）、多核桿菌屬（Polynucleobacter,0.35%～0.61%）、發光桿菌屬（Ilumatobacter 0.25%～0.51%）、甲基單胞菌屬（Methylocystis,0.21%～0.35%）、黃桿菌屬（Flavobacterium,0.13%～0.24%）、分枝桿菌屬（Sediminibacterium,0.08%～0.16%）、微小桿菌屬（Exiguobacterium,0.00%～0.62%）等。

圖5 石山口水庫水體中主要優勢菌門群落結構組成Fig.5 The main bacterial dominant community structure composition in waters of Shishankou Reservoir at phylum level

2.3 微生物群落的空間分布

聚類樹狀圖（圖6）直接顯示了石山口水庫水體7 個樣品間微生物群落多樣性的相似性。1#采樣點的0 m 處與其他采樣點差異較大。2#采樣點的0 m、3 m 處歸聚為一類，說明這兩處采樣點微生物群落組成結構較為相似。3#采樣點的0 m、4 m 處歸聚為一類，說明這兩處微生物群落組成結構較為相似。1#采樣點的3 m 處與3#采樣點的8 m 處歸聚為一類，微生物群落組成結構較為相似。總之，石山口水庫不同層次水體的微生物群落結構組成差異較小。

圖6 石山口水庫微生物聚類樹狀圖Fig.6 Microbial clustering dendrogram in Shishankou Reservoir

圖7 為石山口水庫水體微生物PCA 分析，圖中的點代表各樣品，樣品間相似度越低在空間距離上越遠，反之，樣品間的相似度越高，在圖上的距離越近。由圖7 可知，1#采樣點兩處距離較大，即相似度較低。2#、3#采樣點的0 m、4 m 處距離較近，即這幾處的相似度較高。而3#采樣點的8 m 處與其他幾處距離都較遠，則證明此處與其他幾處相似度極低，微生物群落結構差異較大。

圖7 石山口水庫微生物PCA 分析Fig.7 Microbial PCA analysis in Shishankou Reservoir

3 討論

3.1 石山口水庫不同方位微生物群落結構特征

本研究中，3#采樣點8 m 處的Shannon 指數高于其他幾個采樣點，表明3#采樣點8 m 處的微生物群落結構與其他幾個采樣點差異較大。這可能是水體深度較大，滿足厭氧微生物類群的生存環境條件。石山口水庫平均水深為9.3 m，而3#采樣點的8 m 處距離水庫底部較近，有機物沉積在水體底部，致有機物含量較高，故而3#采樣點8 m 處的微生物多樣性相比于其他采樣點更加豐富。石山口水庫水體中主要優勢菌群落結構組成表明，微生物群落結構組成大都相似。因此石山口水庫壩前水體與其他支流處微生物物種組成相似。主成分分析圖表明，除了3#采樣點水體深度較大，與其他樣品距離較大，差異較大，其他采樣點距離都較近，微生物群落結構大都也一樣。

3.2 不同微生物群落結構對漁業養殖模式的影響

本研究中，大部分優勢菌種常見于一些富營養化水體中，說明石山口水庫有富營養化趨勢。水體中微生物群落結構組成和多樣性并不只與水體營養狀況有關，水中浮游藻類增多，也會極大影響濾食性魚類捕食作用。實踐表明：在水中適當增加鰱的數量，降低鳙的數量會有利影響水質，使水體浮游動物數量增加，浮游植物數量減少，有效控制水體富營養化，阻止其進一步惡化。

私人承包使石山口水庫投放魚體質量為1.5～2.0 kg 的大規格鰱鳙。魚規格越大、越成熟，漁業模式就越穩定，水質狀況會隨著漁業狀況而變化，水質又會影響細菌狀況。用水體各理化指標檢測評價以及水中生物指標檢測評價相結合的方法發現，水體富營養化會嚴重破壞水體微生物群落結構，擾亂微生物群落生態系統的穩定性。

石山口水庫屬于淮河流域，而南灣水庫位于淮河支流浉河上，故而其漁業模式相近。李林春[12]在研究南灣水庫時通過調節鰱鳙的放養比例發現，適當增加鰱鳙比例雖然不能完全改變水庫的富營養化狀態，但卻可以使水質得到一定的改善。所以通過調整漁業養殖模式可以在一定程度上改善水體的營養狀況。

目前，生態修復水體富營養化的對策很多，但都很難起到可觀的成效，所以就極其缺乏一種效果好、價格低廉、又能全面推廣的生態治理方法。研究表明，發展一種健康生態養殖模式，應適當增加鰱鳙放養比例，控制兇猛肉食性魚類，是一種保護水質，實現水庫漁業高效可持續發展的一種有效途徑[13]。