果蔬發酵液中3 株乳桿菌的體外功能特性研究

周笑犁，王艷麗，吳承木，朱光旭，潘滿林

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省普通高等學校功能食品重點實驗室，貴州 貴陽 550005；3.貴陽學院生物與環境工程學院，貴州 貴陽 550005）

近年來，由于人們生活水平的不斷提高，高糖高脂飲食攝入越來越多，且心血管疾病、消化系統疾病、呼吸系統疾病等慢性疾病的患病率與日俱增，這與機體內自由基的過度累積促進了機體組織細胞的衰老和凋亡有關。并且，機體內血液膽固醇含量的增高也是誘發心血管疾病的重要原因[1]。因此，如何有效消除機體內自由基，控制高膽固醇等心血管系統疾病的誘因成為研究關注的焦點。有報道稱，若長期飲用酸駝奶、酸馬奶等乳酸菌發酵奶制品可降低人體患心血管疾病風險[2-3]。其中乳酸菌作為各類發酵制品的重要組分之一，不僅能改善食品的發酵性能、風味特性等，還能抑制有害菌的增殖，具有協調人體代謝、抗腫瘤、降低膽固醇水平、改善肝功能、緩解乳糖不耐癥和增強免疫等功能活性[4-7]。

亞硝酸鹽作為常見的食品添加劑之一，存在于許多儲藏性或發酵食品中。由于亞硝酸鹽在食品中廣泛存在，它可能會與食品中蛋白質分解的胺類物質結合成為亞硝基化合物，從而對人體產生急性中毒、致癌作用及其他危害[8-9]。已有報道乳酸菌[9]、部分芽孢桿菌[10]等對亞硝酸鹽也具有一定的降解能力，如LP9010 具有高效降解亞硝酸鹽的能力[11]，王英等[8]從農家自制的酸豆角中分離到1 株具有強降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌。但這些益生特性卻有著菌種和菌株的特異性，因此從豐富的發酵資源中篩選具有開發潛力的乳酸菌具有重要的現實意義。

課題組前期發現果蔬自然發酵液中涵蓋了細菌和真菌兩大類，且以細菌占絕對優勢；并發現發酵體系中亞硝酸鹽含量呈先增加后降低的趨勢，與此同時乳酸菌也在發酵中后期呈現快速增長的趨勢[12]。進而從中分離得到了3 株優勢乳桿菌，發現它們具有良好的生長特性，及高溫、高鹽、膽鹽及人工胃、腸耐受特性[13]。因此，本文以前期鑒定的3 株乳桿菌為實驗材料，進一步探究它們的表面特性、抗氧化能力差異，并分別對膽固醇、亞硝酸鹽等降解能力進行評價；旨在為發酵食品的菌株功能特性挖掘提供理論依據，對其應用于健康食品的制備和保護人體健康具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumstrain Heal19，簡稱L1）、乳桿菌屬（Lactobacillus brevisstrain LMT1-73，簡稱L2）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumstrain SRCM100440，簡稱L3） 均為前期從番茄自然發酵液中分離所得[13]；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵 均為分析純，科密歐化學試劑（天津市）有限公司；MRS 培養基 杭州百思生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸、硫代巴比妥酸、二甲苯、雙氧水、六氰合鐵酸鉀、三氯化鐵 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；亞油酸 上海卡伊生物技術有限公司；膽固醇南京奧多福尼生物科技有限公司；膽固醇檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

SPX-1508BII 生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限責任公司；UV2700 紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司；xMark 酶標儀 安諾倫（北京）生物科技有限公司；DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器 予華儀器（鞏義市）責任公司；TGL-16A 高速臺式離心機湖南平凡科技有限公司；LDZM-60L 高壓滅菌鍋上海審安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 表面特性的測定

1.2.1.1 表面疏水性測定 MRS 液體培養基培養3 株乳桿菌一定時間，5000 r/min 離心10 min 收集菌體，用生理鹽水洗滌，并調整受試菌株菌液濃度，使其在600 nm 波長下A 值約為0.5。取菌懸液，加入等體積二甲苯，漩渦振蕩后，在室溫下培養1 h（此時形成兩相體系）。吸取2 mL 水相，以生理鹽水為空白對照，測定A600[14-15]。

其中A0和A 分別是與二甲苯混勻前后水相在600 nm 下測量所得的A 值。

1.2.1.2 自身凝聚力測定 MRS 液體培養基培養3 株乳桿菌，5000 r/min 離心10 min 收集菌體，用生理鹽水洗滌，用生理鹽水調整受試菌株的菌液濃度，使其在600 nm 波長下A 值約為0.5。取調整好的菌懸液于試管中，靜置，分別靜置1、2、3、4、5、12、24 h后吸取上層溶液于600 nm 波長下測其吸光度[14-15]。

其中A0和Ai分別是與自凝聚前后上層溶液在600 nm 下測量所得的A 值。

1.2.2 抗氧化能力測定

1.2.2.1 上清液及菌體重懸液的制備 乳桿菌MRS培養基中37 ℃培養16～18 h，4 ℃ 3000 r/min 離心5 min 并收集上清夜，放入冰箱4 ℃下保存，備用；對剩下的菌體沉淀進行洗滌兩次后重懸，調整菌數濃度至1×109CFU/mL。

1.2.2.2 DPPH 自由基清除能力 分別取0.4 mmol/L DPPH 乙醇溶液以及2 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）于試管混勻，置于室溫下避光反應30 min，然后5000 r/min 離心10 min，以無水乙醇為空白對照，在波長517 nm 處測定樣品吸光值[16-18]（Ai），無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液的反應體系為樣品空白組（Aj），以無水乙醇代替樣品液的反應體系為控制組（A0），所有樣品測定三次平行。

1.2.2.3 羥基自由基的清除能力 在1 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）中分別加入9 mmol/L FeSO41 mL 和9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應，在暗室下反應20 min，在510 nm 波長處測各組樣品的吸光值[16-18]。羥基自由基清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100式中：Ai：樣品的吸光度；Aj：水替代H2O2的吸光度；A0：水替代樣品的吸光度。

1.2.2.4 抗脂質過氧化能力 分別在3 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）中加入0.5 mL 0.02 mol/L PBS 溶液、2.5 mL 亞油酸乳化液、1 mL 1%FeSO4，37 ℃水浴1.5 h 后再依次加入0.2 mL 4%三氯乙酸和2 mL 0.8%硫代巴比妥酸，100 ℃水浴30 min 后迅速冷卻至室溫，然后4000 r/min 離心15 min，最后收集上清液于532 nm 下測吸光度（A1），對照組以等體積蒸餾水代替樣品（A0）[16-18]。計算抗脂質過氧化能力。

1.2.2.5 還原能力 分別在1 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）中加入2.5 mL PBS 緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50 ℃水浴保溫20 min 后迅速冷卻，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，5000 r/min 離心10 min，在2.5 mL 上清液中加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，將其混合充分后靜置10 min，在700 nm 波長處測吸光值[16-18]。

1.2.3 降解亞硝酸鹽能力測定

1.2.3.1 亞硝酸鹽降解能力 取100 μL 菌液（1×109CFU/mL）接種到10 mL 含有200 mg/L NaNO2的MRS 肉湯中，37 ℃培養24、48 h[8-9]。參照國標GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法繪制標準曲線，以不含亞硝酸鈉的MRS 肉湯為空白對照，并測定樣品中的亞硝酸鹽含量。標準亞硝酸鹽溶液繪制標準曲線，y=0.0285x+0.0014，R2=0.9998。

式中：C0為未接菌含亞硝酸鈉培養基中亞硝酸鈉含量；C1為接菌培養后培養基中亞硝酸鈉含量。

1.2.3.2 乳桿菌對不同濃度亞硝酸鹽的降解能力取100 μL 菌液（1×109CFU/mL）接種到亞硝酸鹽含量分別為200、400、600、800、1000 mg/L 的10 mL MRS 肉湯中，37 ℃培養0、6、12 h 后，分析亞硝酸鹽降解率。

1.2.4 降解膽固醇能力測定

1.2.4.1 膽固醇降解率 按5%菌液（1×109CFU/mL）接種至膽固醇培養基（在牛膽鹽0.2 g，蔗糖酯0.1 g，膽固醇0.1 g 和1 mL 吐溫-80 中加入5 mL 冰乙酸后60 ℃超聲15 min，將得到膠束溶液快速加入到MRS 液體培養基中，快速攪拌均勻后滅菌，室溫冷卻備用）[17,19]，37 ℃培養24 h，1000 r/min 離心10 min；取上清液按膽固醇試劑盒測定方法進行測定，并計算降解率。

式中：C0為不接菌的MRS-CHOL 培養基的膽固醇含量；C1為接入樣品24 h 后的培養基中膽固醇含量。

1.2.4.2 菌體與上清液降解能力 參照1.2.2.1 方法得到上清液和菌體重懸液，加入含有膽固醇的培養基，37 ℃培養24 h，測定膽固醇含量，計算降解率[20]。

1.2.4.3 上清液降脂成分初探 L1 上清液中多糖、蛋白質和脂肪分別采取乙醇沉淀法、乙酸乙酯抽提法和硫酸銨沉淀法進行提取[19]，然后加入膽固醇培養基，37 ℃培養24 h，測定膽固醇含量，計算降解率。

1.3 數據處理

每組試驗重復3 次，采用IBM SPSS 22.0 進行統計分析，數據用平均值±標準差表示，使用Duncan等多重方法對數據進行比較，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 表面特性分析

疏水性試驗結果如圖1（A）所示，除菌株L2 外（P＜0.05），其他兩株菌具有較高的疏水性，均超過50%，且差異不顯著（P＞0.05）。表面疏水性作為考察乳桿菌粘附性的主要指標，乳桿菌只有具備一定的黏附能力，才能防止因腸道的蠕動而使乳酸菌被快速排除。有研究發現[14,18]益生菌生物膜疏水能力與黏附能力呈正相關，疏水性越高，粘附性則越強[21]。課題組前期研究發現三株乳桿菌在一定程度上能耐受胃腸環境[13]，通過疏水性實驗又進一步發現L1 和L3具有較高的表面疏水性，這可能有助于細菌粘附到腸粘膜，更容易在人體腸道中定植，在人體中發揮益生作用[14-15]。

圖1 乳桿菌的表面特性Fig.1 Surface properties of Lactobacillus

由圖1（B）可知，3 株乳桿菌的自凝聚率隨著靜置時間的延長而逐漸增大，其中L1 在3 h 內自凝聚率變化差異不顯著（P＞0.05），3 株菌從3 h 后自凝聚率顯著增大（P＜0.05）。靜置4 h 時，3 株菌的自動凝集率均超過20%，12 h 后自動聚集超過70%（P＜0.05），其中L1 的自凝聚力顯著低于其他各組（P＜0.05）。本實驗中的3 株乳桿菌均低于龔虹等[14]報道的德氏乳桿菌DM8909 和羅伊乳桿菌RC-14 在4 h 的自凝聚能力，而與戊糖片球菌和鼠李糖乳桿菌PB01 自凝聚能力相似[15]。說明本實驗從果蔬發酵液中分離得到的3 株優勢乳桿菌自凝率速率較低，需要12 h 才能具有較好的作用，說明不同來源的乳桿菌自凝聚能力快慢存在菌株差異性。

2.2 抗氧化能力分析

DPPH 法、羥自由基清除能力、還原力等都是測定抗氧化能力的常用方法。但是這些測定結果都只能表明某一種或某一水平上的抗氧化能力，故本實驗從多維度考察乳桿菌的抗氧化能力差異。

由圖2（A）可以得出，3 株乳桿菌具有較好的DPPH 自由基清除能力，上清液和菌體重懸液的清除率分別不低于90%和80%；且三株菌之間的清除能力差異不顯著（P＞0.05）；上清液的清除率顯著高于菌體重懸液（P＜0.05）。這可能是由于乳桿菌上清液中含有更多能夠清除DPPH 自由基的物質，如多糖等具有一定的供氫能力，通過氫原子轉移或電子轉移，對DPPH 自由基發生中和作用[22-23]。

圖2（B）顯示，3 株乳酸桿菌上清液的清除羥自由基能力顯著高于菌體重懸液（P＜0.05），其中L1、L3 的上清液比L2 具有更強的羥自由基清除能力（P＜0.05），而L2 的菌體重懸液則比L1、L3 具有更強的羥自由基清除能力（P＜0.05）。表明3 株乳酸桿菌清除羥自由基的活性物質主要在代謝產物中而非菌體本身。這與劉倩霞等[24]、丁麗麗等[25]研究相似，這可能是乳桿菌在生長、代謝過程中產生了Fe2+、Cu2+等金屬離子螯合物等并分泌到培養上清液中，參與氧化反應，從而使羥基自由基變少[24-25]。而不同乳酸菌清除自由基的能力存在一定差異，可能是因為其活性物質及其含量不一樣[26-27]。

圖2 3 株乳酸桿菌的體外抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of 3 strains of Lactobacillus in vitro

由圖2（C）可知，3 株乳桿菌的上清液和菌體重懸液具有一定抗脂質過氧化的能力，尤其菌體重懸液比上清液具有更強的抗脂質過氧化能力（P＜0.05）。王悅齊等[28]研究結果為：乳酸菌中具有抗脂質過氧化的物質大部分在上清液中；說明本實驗中乳桿菌不僅上清液具有良好的清除自由基的能力，菌體細胞中也可能含有抑制催化亞油酸脂質過氧化的作用。并且無論菌體還是上清液，L2 都表現出更好的抗氧化能力（P＜0.05），L1 則相對較弱（P＜0.05）；說明抗脂質過氧化的活性物質在不同乳桿菌株中的含量分布存在差異。

由圖2（D）可知，3 株乳桿菌均具有較強的還原能力，且上清液的還原能力顯著強于菌體重懸液（P＜0.05），其中L3 的還原能力顯著高于L1、L2（P＜0.05）；表明乳桿菌上清液中代謝產物作為電子供應者，它供應的電子不僅能使Fe3+還原為 Fe2+，也可以與自由基反應[29]。

從上述抗氧化活性指標可得出，三株乳桿菌對體外活性氧積累具有一定調節作用，但又存在一定差異，如上清液具有更強的DPPH 自由基、羥自由基清除率及還原能力，而菌體重懸液則主要表現出更好的抗脂質氧化能力；其中L1 和L3 上清液具有更強羥自由基清除率，L2 則具有較強的抗脂質過氧化能力，L3 上清液具有較好的還原能力；其原因可能是不同乳桿菌及其所分泌的抗氧化物質存在種類、數量和濃度上的區別[30]，有待進一步深入探究3 株乳桿菌代謝產物的差異。

2.3 降解亞硝酸鹽能力分析

乳桿菌通常在食品發酵中表現出良好的降解亞硝酸鹽功能[9]，課題組前期研究發現番茄自然發酵過程中亞硝酸鹽在前20 d 內逐漸增加，隨后亞硝酸鹽含量迅速降低，與此同時乳酸菌豐度也逐漸增加[12]，因此對此時發酵體系中分離的優勢乳桿菌進行亞硝酸鹽降解能力的探究。在本實驗的3 株菌培養24 h時，亞硝酸鹽降解率在70%以上，尤其是L1 和L3 顯著高于L2（P＜0.05）；培養48 h 后，3 株菌的降解率均超過了90%（圖3）。其中，2 株植物乳桿菌對亞硝酸鹽的降解速度較快，降解能力最強，在24 h 基本趨于穩定；這可能由于植物乳桿菌具有更豐富的代謝產物亞硝酸還原酶可降解或清除亞硝酸鹽[8-11]。而L2 的降解力從24 h 到48 h 有顯著增加（P＜0.05），這可能與菌株自身的生長能力有一定關系。

圖3 3 株乳桿菌對亞硝酸鹽降解能力Fig.3 Degradation ability of 3 strains of Lactobacillus to nitrite

然后考察了3 株乳桿菌12 h 內在不同亞硝酸鹽濃度下的變化規律，結果見圖4。隨著亞硝酸鹽濃度的增加，3 株乳桿菌對其降解率逐漸下降，但亞硝酸濃度為1 g/L 時，20 h 后其降解率仍有20%左右。由此可見，本實驗從果蔬發酵液中分離得到的3 株優勢乳桿菌具有良好的亞硝酸鹽耐受和降解能力，這可為開發有關降亞硝酸鹽發酵食品提供一定的理論基礎。

圖4 3 株乳桿菌對不同濃度亞硝酸鹽的降解情況Fig.4 Degradation ratio of NaNO2 by Lactobacillus under different concentration of NaNO2

2.4 降解膽固醇能力分析

體外降膽固醇實驗作為判定課題組前期從果蔬發酵液中分離得到的乳桿菌是否具有潛在降脂能力的重要標準之一。由圖5 可知，3 株乳桿菌培養24 h后對膽固醇的降解率均不低于19%，說明本實驗的3 株乳桿菌對膽固醇具有一定潛在降解特效。已有報道發酵果蔬中6 種乳酸菌對膽固醇的清除率在18.5%～28%之間[31]，本實驗結果與之相近。其中L1 的降解能力最高，但略低于林斌等[32]從自然發酵酸乳中植物乳桿菌HLX37 的膽固醇降解率，而L1 略高于動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF和植物乳桿菌LPL-1 的降解率[33]。相比之下，本研究的3 株乳桿菌的體外降膽固醇能力處于中等水平。再對3 株菌的上清液和菌體重懸液的膽固醇降解能力進行了比較分析，如圖6 所示，結果發現上清液比菌體重懸液具有更強的膽固醇降解能力（P＜0.05）。說明乳桿菌對膽固醇的降解活性主要存在于上清液中，發揮這些降解作用的物質可能為初級和次級代謝產物。因此以具有較強膽固醇降解能力的L1 為對象，進一步探究其上清液中發揮降解膽固醇作用的物質。如圖7 所示，發現L1 上清液發揮降解膽固醇作用的物質大部分為蛋白質和多糖類物質，且這些物質基本均為次級代謝產物；而脂類幾乎不具有降解膽固醇的能力。這可為開發有關降膽固醇產品提供一定的理論基礎。

圖5 菌懸液體外膽固醇降解率Fig.5 Cholesterol degradation rate of bacterial suspension in vitro

圖6 上清液和菌體重懸液對膽固醇的降解能力Fig.6 Cholesterol degradation ability of supernatant and bacterial suspension

圖7 L1 上清液不同組分對膽固醇的降解能力Fig.7 Cholesterol degradation ability of different components of L1 supernatant

3 結論

本研究發現果蔬發酵液中3 株優勢乳桿菌具有良好的表面特性，尤其L3 的表面疏水性和自身凝聚力均表現良好，分別為57.7%和95.2%（24 h），可能對黏附于腸道具有一定積極作用，是益生菌制劑開發應用中的潛力菌。再通過體外功能活性評價，發現3 株菌的上清液具有較強的DPPH 自由基清除率（＞90%）、羥自由基清除率（＞68%）及還原能力（＞1.0），而菌體則主要表現出更好的抗脂質氧化能力（＞35%）；其中L1 和L3 上清液具有更強羥自由基清除率，L2 則具有較強的抗脂質過氧化能力（上清液37.43% vs 菌體55.9%），L3 上清液具有較好的還原能力。并且3 株菌均具有一定亞硝酸鹽耐受和降解能力以及膽固醇降解能力，其中L3 具有更好的亞硝酸鹽降解能力，膽固醇降解能力則主要體現在上清液中。綜上所述，前期從番茄為原料的果蔬發酵液中分離得到的3 株優勢乳桿菌均有作為發酵果蔬或功能性益生產品的潛在應用前景，也可進一步嘗試將幾株菌混合或與其他益生菌協同發酵果蔬原料，開發營養功效更全面的益生食品。