食品中亞硝酸鹽檢測方法的研究進展

李 卉，李 莉

（1.北京林業大學生物學院，北京 100083；2.北京林業大學理學院，北京 100083）

亞硝酸鹽存在于多種食品中，主要有兩種來源，一是蔬菜在腌制或烹飪時，其中的硝酸鹽在還原菌作用下被還原成亞硝酸鹽。二是亞硝酸鹽有抗菌、抗氧化性等功能，作為食品添加劑廣泛應用于香腸等肉制品產業中。然而亞硝酸鹽的過量攝入對人體存在間接致癌、致畸、致突變性等風險[1]，單次攝入0.3 g以上亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡[2]。

為了確保食品安全，近年來許多國家和地區制定了亞硝酸鹽在蔬菜、肉制品等食品中嚴格的含量標準，因此食品中亞硝酸鹽含量的準確檢測意義重大。由于食品種類繁多，成分復雜，目前大多數檢測方法并不能直接對食品中的亞硝酸鹽進行檢測，而是需要在檢測前先除去其中的干擾物，有時還要將亞硝酸鹽轉化為其它化合物后再進行檢測，因此本文首先對多種食品樣品的常規預處理方式進行了總結。近年來國內外檢測食品中亞硝酸鹽的方法很多，隨著實驗技術的發展和研究的深入，許多方法也在不斷地優化，在提高檢測限、檢測精度和適用范圍等方面取得了不同的進展。本文對當前國內外檢測食品中亞硝酸鹽的主要方法及其進展進行了綜述，比較了各種檢測方法的原理、優缺點及檢測限，不僅為目前選擇各類食品中亞硝酸鹽的檢測方法提供參考依據，也為開發食品中亞硝酸鹽檢測的新方法提供思路。

1 不同樣品的常規前處理方法

相比水樣，食品的種類繁多，成分復雜。在檢測其中的亞硝酸鹽含量時，通常都需要排除蛋白質、脂肪、色素等其它成分的干擾，得到無色澄清的待測液，以保證檢測體系不被干擾，從而提高檢測方法的準確度?？偨Y目前所用的樣品預處理方法主要有如下幾種。

1.1 水樣前處理方法

水樣只需經過常規前處理即可。無色澄清水樣直接取樣，用酸堿調至近中性，再進行檢測。這類干凈的水樣經過此方法處理后適用于各種檢測方法。如Zhang 等[3]和Yaqoob 等[4]分別用氣相色譜法和化學發光法檢測了地表水（雨水、河水）中的亞硝酸鹽，操作簡單，檢測結果準確性高。

渾濁或顏色較深的水樣可加入適量氫氧化鋁懸浮液或活性炭攪拌后靜置沉淀，過濾后用酸堿將濾液調至近中性再進行檢測。洪徐華[5]將水樣經過此前處理后利用分光光度法和離子色譜法定量檢測了亞硝酸鹽，加標回收率范圍分別為98.58～106.49%和101.85～105.31%，具有較高檢測準確性。Suma 等[6]則利用活性炭處理污水后用電化學傳感器法測定亞硝酸鹽，檢測限達到10.71 μmol/L。此前處理方法能夠實現復雜水樣中亞硝酸鹽的檢測，但一般處理時間比較長。

或者用0.22 μm 或0.45 μm 微孔膜過濾水樣中的雜質后再檢測其中的亞硝酸鹽，Jing 等[7]和Zhang等[8]將水樣用膜過濾后利用熒光光度法檢測了其中的亞硝酸鹽，檢測限達到0.1 μmol/L。Zhang 等[9]用膜過濾了海水之后利用氣相分子吸收光譜法檢測了亞硝酸鹽，在0.021～5 mmol/L 濃度范圍內能夠線性檢測NO2-。比較而言，膜過濾處理方法可使水樣更加潔凈，適用于精密儀器檢測亞硝酸鹽，但由于濾膜較小，限制了樣品處理量。

1.2 固體樣品前處理方法

1.2.1 含蛋白質/脂肪的樣品前處理方法 需先除去樣品中的蛋白質和油脂?；鹜取⑷庵破返裙腆w樣品壓碎搗磨后，加入硼砂至飽和，充分攪拌后加熱15 min后冷卻、沉淀蛋白質，再加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，過濾除去蛋白質和脂肪，濾液備用。若固體樣品顏色較深，得到的濾液不澄清或有顏色，則需要用氫氧化鋁乳液對濾液脫色和澄清處理后備用。應用此方法處理待測樣品后，張小梅[10]和朱勇等[11]用紫外分光光度法分別檢測了豬肉、豆干、甜面醬、咸菜和香椿中的亞硝酸鹽，熊海濤[12]用催化光度法檢測了香腸中的亞硝酸鹽，檢測范圍為0.04～0.80 μg/mL。王雨蒙[13]用滴定法檢測罐頭、牛奶中的亞硝酸鹽，Jing 等[7]用熒光光度法檢測了香腸和泡菜中的亞硝酸鹽，檢測線性范圍8～100 μmol/L。此前處理方法是檢測食品中亞硝酸鹽最常用的方法，也是國標規定中的前處理方法，適用范圍廣，但操作步驟繁瑣。

也可以用乙腈等有機溶劑沉淀樣品中的蛋白質。Fabiana 等[14]用此法處理了嬰兒食品，用毛細管電泳法檢測了其中的亞硝酸鹽，線性檢測范圍為5～55 mg/L。該處理方法較為簡單，但只能除去蛋白質，并且有機溶劑有一定的毒性。

1.2.2 不含蛋白質/脂肪的固體樣品前處理方法 多為果蔬類樣品，主要是將待測的NO2-釋放出來，有些還要進行脫色處理。熊海濤[12]將小青菜樣品烘干、粉碎過篩，用V硝酸:V高氯酸=5:1 混合酸加熱消化至溶液為無色透明，利用催化光度法檢測亞硝酸鹽。孫鳳春[15]將蔬菜切碎，制成勻漿后加沸水稀釋并加活性炭加熱脫色、過濾得清亮無色提取液，利用紫外分光光度法檢測亞硝酸鹽。Biswas 等[16]和Shu 等[17]則將蔬菜切片碾碎均質，經離心和過濾得到蔬菜提取液后，調整提取液的pH，分別利用熒光光度法和毛細管電泳法檢測亞硝酸鹽，得到檢測限分別為0.6 μg/L和0.05 μg/mL。這類處理方法操作簡便，使用儀器較為基礎，但相對應用范圍較小。

2 亞硝酸鹽的檢測方法

目前國內外亞硝酸鹽的檢測方法主要分為光度法、色譜法、化學發光法、電化學法、滴定法等幾大類。

2.1 光度法

光度法可以分為可見分光光度法[18]、紫外分光光度法[19]、熒光光度法[20-21]等。這些方法具有操作簡便、成本低等共同特點。

2.1.1 可見分光光度法 可見分光光度法是食品安全國家標準GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的方法之一。亞硝酸鹽本身對可見光無吸收，故可見分光光度法的測試原理是先利用待測樣品中的亞硝酸鹽與對氨基苯磺酰胺在酸性介質中反應生成重氮鹽，再將重氮鹽與鹽酸萘乙二胺偶合生成紫紅色偶氮染料，測定其在540 nm 處吸光度，樣品中亞硝酸鹽含量與該吸光度成正比，通過標準曲線定量分析亞硝酸鹽的含量。洪徐華[5]應用此法檢測了水中的亞硝酸鹽，測得檢測限為1.6 μg/L。肖琴等[18]探究了此方法的檢測波長、顯色劑、顯色時間等因素對吸光度的影響并應用于奶制品中亞硝酸鹽的檢測，檢測限為9 μg/L。殷紫[22]和陳翠霞等[23]分別進一步探究了溫度和比色皿材質對此方法吸光度的影響，并檢測了醬菜和香腸中的亞硝酸鹽，完善了可見分光光度法的最優檢測條件。吳興興等[24]將此方法拓展應用到藥用輔料中檢測亞硝酸鹽，表明在0～7.96 μg/L 的亞硝酸鹽濃度范圍內呈良好的線性關系。該方法的優點在于操作簡單[25]，重復性好，適合大批量樣品分析，可直接測定水樣中的亞硝酸根。但該方法的缺點是靈敏度不高，易受Cu2+、Fe3+等離子的干擾，顯色反應不夠穩定，易受溫度和顯色時間的影響，分析時間長，并且所用試劑種類較多且多數具有明顯毒性。

催化光度法是在分光光度法的基礎上發展起來的，是基于亞硝酸根對某一顯色反應或褪色反應的催化作用，利用可見分光光度法間接測定亞硝酸鹽的方法。Ali 等[26]和霍歡[27]利用亞硝酸鹽在硫酸介質中對溴酸鉀氧化燦爛甲酚藍的催化作用檢測了牛肉香腸和環境水中的亞硝酸鹽含量，檢測限分別為1.6 mg/L 和2.9×10-3mg/L。趙樺萍等[28]在磷酸介質中加入增敏劑β-環糊精提高了亞硝酸根催化溴酸鉀氧化羅丹明B褪色反應的靈敏度，應用于紅腸等食品檢測亞硝酸鹽，線性檢測范圍為4×10-4～0.5 μg/mL。熊海濤[12]利用硫酸條件下亞硝酸根催化氧化二價鐵為三價鐵檢測了香腸和小青菜中的亞硝酸鹽，檢測限為0.013 μg/mL。該方法避免了使用有毒試劑，抗干擾能力強，具有快速、簡便、靈敏度高等優點，可以監測較微量亞硝酸鹽，但缺點是重現性不好。

2.1.2 紫外分光光度法 亞硝酸根在210 nm 處雖有最大吸收，但與硝酸根等物質的吸收峰（203 nm）互相干擾，不經分離難以進行準確測定，可以用雙波長紫外分光光度法進行檢測，但是通常是先將亞硝酸鹽轉化為偶氮染料再利用其濃度與吸光度的關系繪制標準曲線，來定量分析亞硝酸鹽的含量。

孫鳳春[15]用雙波長紫外分光光度法直接檢測了大白菜和甘藍中的亞硝酸鹽，加標回收率為93%～103%，與國標法相比誤差在1.98%～4.26%。楊兵等[29]利用品紅與亞硝酸根在酸性條件下發生重氮化反應用紫外分光光度法檢測了水中的亞硝酸鹽，表明在0～14.5 μg/mL 范圍內亞硝酸根濃度與紫外吸光度存在線性關系。張小梅[10]基于鄰苯二胺與亞硝酸鹽的反應用紫外分光光度法檢測了鹵豬肉、豆干、甜面醬和咸菜中的亞硝酸鹽，擴大了此方法在食品中的應用范圍，檢測線性范圍提高到0～6 μg/mL。紫外分光光度法操作簡便、體系穩定，適用于檢測大批量樣品，但其靈敏度較低。

2.1.3 熒光光度法 在用熒光光度法檢測亞硝酸鹽時需使用熒光探針，基于亞硝酸鹽的亞硝化反應、重氮化反應或誘導探針物質聚集使得探針熒光增強或減弱，熒光強度的變化與亞硝酸鹽的濃度成線性關系，從而實現對食品中亞硝酸鹽的測定。

Biswas 等[16]基于亞硝酸鹽對紫脲酸銨天然熒光的猝滅作用檢測了水和土壤中的微量亞硝酸鹽，檢測限為0.6 μg/L。王秋花[30]考察了二氫吡啶類、芳香鄰二胺類等多種熒光探針在檢測亞硝酸鹽中的應用，檢測限可達到1.9×10-8mol/L。Jing 等[7]利用亞硝酸鹽誘導氮摻雜碳點（N-CDs）探針聚集使熒光增強檢測了自來水以及香腸、泡菜中的亞硝酸鹽，拓展了熒光光度法在食品中的應用，檢測限為0.65 μmol/L。熒光光度法可以直接、簡便地檢測水中亞硝酸根離子，具有靈敏度高、選擇性好、檢測限低等優點。但由于對環境因素較敏感，干擾因素較多，且發生熒光強度的物質較少，熒光穩定性差，因此該方法的應用比較受限。

2.2 色譜法

色譜法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相分子吸收光譜法、毛細管電泳法等。這些方法具有準確度高、選擇性強的特點，但都需要昂貴的儀器，成本高。

Zhang 等[3]先在酸性條件下使水樣中的與甜蜜素反應生成環己烯，再用頂空進樣的方式用氣相色譜分析確定了亞硝酸鹽含量，線性檢測范圍為0.0012～0.500 mg/L，檢測限為0.46 μg/L。張蓓等[31]用類似的方法檢測了嬰幼兒配方食品中的亞硝酸鹽，線性檢測范圍為0.03～18.58 mg/kg，測得檢測限為0.03 mg/kg。Markus 等[32]先將金槍魚前處理后，將樣品中的轉化為N2O，再用此方法檢測了其中的亞硝酸鹽含量，檢測限為20 μg/kg。氣相色譜法可以避免樣品中其他成分對的測定造成的干擾，靈敏度高、檢測快速、準確度高。但缺點是樣品處理時間長且過程復雜，數據分析復雜。

2.2.2 液相色譜法 液相色譜法主要有離子色譜法和高效液相色譜法。均包括固定相、流動相和檢測器三個部分，基于亞硝酸根與體系中其他物質呈現出不同的溶解及吸附性能對亞硝酸根進行分離再通過電導檢測器或紫外檢測器進行定量分析。

離子色譜法也是食品安全國家標準GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的方法之一。該方法發展于20 世紀70 年代，近年來發展很快，并且高效液相色譜儀與質譜、熒光等結構儀器的聯用也屢見報道。Fouzia 等[33]用離子排斥色譜法檢測了水中的微量亞硝酸鹽，檢測限達到0.5 μg/L。Hu 等[34]基于陰離子交換柱和紫外吸收檢測器檢測了藥物中的亞硝酸鹽，擴大了液相色譜的檢測范圍，檢測限為0.918 μg/g。王小芳等[35]將高效液相色譜與熒光聯用建立了一種高靈敏度的檢測方法并檢測了嬰幼兒奶粉中的亞硝酸鹽，線性檢測范圍為0～200 μg/L，相關系數達到0.9999，檢測限為0.015 mg/kg。液相色譜法靈敏度高、分離效率高、重復性好、選擇性強且可以與其他多種離子一同進行定量檢測[36]，但儀器昂貴、分析成本高，色譜柱及儀器需要定期維護。

2.2.3 毛細管電泳法 毛細管電泳法包含電泳、色譜及其交叉內容。是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中亞硝酸鹽與其他組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離亞硝酸鹽的分析方法。該方法的研究和應用于上世紀八十年代在國外迅速發展，我國起步較晚。目前該方法多用于蛋白質、氨基酸等的檢測[37-38]，在硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測方面的研究應用相對較少。

Fabiana 等[14]用此方法檢測了嬰兒食品中的亞硝酸鹽，檢測限為0.09 mg/L。Shu 等[17]優化了亞硝酸根的分離方法用毛細管電泳法檢測了蔬菜中的亞硝酸鹽，將此方法的線性檢測范圍擴大到0.5～100 mg/L，檢測限降低為0.06 mg/L。毛細管電泳法能實現自動化控制，檢測速度快，具有分離效率高、運行時間短、注入量小、樣品量少、同時分析多種陰離子等優點，但毛細管柱的主要缺點是其容量受限，毛細管直徑小、光程短，重現性不好，外界干擾因素多。

2.2.4 氣相分子吸收光譜法 氣相分子吸收光譜法是通過化學反應使水樣中的與酸快速反應生成能吸收特定波長紫外光的NO2氣體，NO2氣體分子濃度與吸光度的關系遵守朗伯-比爾定律，通過測定NO2氣相分子在特定波長下的吸光值，實現亞硝酸鹽的定量分析。

該方法興起于20 世紀70 年代，多用于水質和土壤中亞硝酸鹽的檢測，用于食品中亞硝酸鹽的檢測研究還較少[39]。Zhang 等[9]用此方法檢測了礦泉水和海水中的亞硝酸鹽，檢測限為7 μmol/L。劉豐奎等[40]利用氣相分子吸收光譜法與超聲輔助提取結合檢測了火腿中的亞硝酸鹽，檢測限為44 μg/kg，提高了該方法的靈敏度。該方法具有檢測限低、快速等優點，由于實現了待測物NO2與試樣的分離，因此試樣本身的顏色對結果不會產生干擾，對樣品的清潔度要求不高。其缺點是儀器設備價格昂貴，并且對水樣測定中干擾因素的研究還不全面，故復雜樣品在檢測前需要經過預蒸餾處理。

2.3 化學發光法

化學發光法是由化學反應產生光輻射的一種檢測方法，用于亞硝酸鹽的檢測，主要有氣相化學發光法和液相化學發光法，多用于水體中亞硝酸鹽的檢測。

氣相化學發光法也稱為臭氧化學發光法，先將NO2-還原為NO，NO 與臭氧反應生成的激發態回到基態的過程中會釋放出光子，產生化學發光，光信號與亞硝酸鹽含量成正比，由此實現對亞硝酸鹽的定量檢測。王燕等[41]利用此原理檢測了天然水體中的亞硝酸鹽，并優化了反應溫度、氣體流速等反應條件，檢測限為10 nmol/L。臭氧化學發光法快速、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡便，缺點是痕量的氧氣也可以氧化NO，需要在高于600 ℃的燃燒溫度下進行反應才能防止NO 氧化，此外該法對還原劑的強度有較高要求，常用還原劑有NaI、VC-HAc 等。

2.4 電化學法

電化學法主要指電化學傳感器法，是近二十年來發展起來的一種快速、靈敏度高的檢測方法，可用于檢測亞硝酸鹽。檢測原理是基于亞硝酸鹽在電極表面發生電氧化產生的電化學信號與亞硝酸鹽濃度在一定范圍內成正比，根據二者之間的線性關系對亞硝酸鹽進行定量分析。常用的是電流型電化學傳感器，由于在裸電極上的電化學信號較小，抗干擾性差，可以將不同的材料修飾在電極表面以增強電極活性，提高亞硝酸鹽在電極表面的電催化氧化活性，提高檢測的靈敏度和抗干擾性。因此，探索新型電極修飾材料成為研究熱點。

修飾電極的材料種類多樣，包括結構獨特的納米材料，導電性能良好的碳材料如碳納米管/石墨烯等，導電聚合物以及納米材料與導電材料的復合材料等。連歡等[43]用納米氧化鋅修飾玻碳電極，探究了修飾材料在電極上的滴涂體積、富集時間等條件對電催化氧化的影響，并檢測了雙匯香腸中的亞硝酸鹽，檢測限為0.3 μmol/L。Cheng 等[44]通過控制氧化鋅納米修飾材料的分散度制成電化學傳感器，進一步優化了電壓、修飾劑用量以及pH 等檢測條件，用于檢測火腿、泡菜等食品中的亞硝酸鹽，提高了該方法的重現性和靈敏度，線性檢測范圍為0.3 μmol/L～6.14 mmol/L，檢測限為0.21 μmol/L。Turdean 等[45]利用肌紅蛋白-單壁碳納米管修飾的石墨電極檢測了肉制品中的亞硝酸鹽，檢測限為0.95 mmol/L。闕小峰等[46]利用石墨烯修飾玻碳電極，在前人的研究基礎上進一步優化了電解液的種類和pH，檢測了乳粉、白菜等食品中的亞硝酸鹽，檢測限可達到0.072 μmol/L。張怡[47]利用氧化碳纖維制成電化學傳感器，增加了電極的活性位點及比表面積，提高了亞硝酸鹽電催化氧化性能，并檢測了水和香腸中的亞硝酸鹽，線性檢測范圍為0.1 μmol/L～3.84 mmol/L，檢測限為0.07 μmol/L。Cao 等[48]利用蛋殼膜吸附Cu2+制成生物炭修飾電極綠色檢測水和香腸中的亞硝酸鹽，提高了電極的傳感能力和穩定性，線性檢測范圍為1～300 μmol/L，檢測限為0.63 μmol/L。Yang 等[49]用鎳納米片負載的二硫化鉬修飾電極檢測自來水中的亞硝酸鹽，并優化了電解液的pH，檢測限為2.48 μmol/L。Zhou 等[50]利用納米金改性石墨烯制成亞硝酸鹽檢測傳感器并探究了沉積方法對傳感器性能的影響，將此方法用于環境水樣，得到檢測限為0.1 nmol/L。

電化學傳感器法可用于檢測自來水、礦泉水、香腸等食品中的亞硝酸鹽，具有高靈敏度、高選擇性和較寬的檢測范圍的優點，并且選擇不同的修飾電極，還可以靈活調節分析檢測的范圍。但電化學傳感器制備及其檢測程序比較繁瑣，需要考慮修飾電極的穩定性和重復性問題。

2.5 滴定分析法

滴定分析法屬于化學分析法，是利用酸性條件下I-離子能被食品中的亞硝酸鹽還原成I2，而I2與淀粉反應變藍，但I2又能被氧化成I-從而使藍色褪去，因此用硫代硫酸鈉溶液滴定測定碘單質的量，可計算出亞硝酸鹽的含量；或者是在酸性溶液中，用KMnO4氧化，根據KMnO4標準溶液消耗量計算出NO2含量，分析中采用KMnO4的粉紅色為指示終點。

周石洋等[51]用硫代硫酸鈉滴定法檢測了一些食品（醬菜、罐頭、牛奶、火腿、肉制品）以及水中的亞硝酸鹽并探究了淀粉用量和酸的種類對滴定結果的影響，檢測限為0.3 mg/kg。范美霞[52]利用KMnO4滴定法測定了皮蛋、鄉巴佬雞蛋、酸白菜等腌制食品中的亞硝酸鹽，并與國標法做對比，證明了此方法的可行性。滴定法不需要特殊設備，操作簡單，出現的誤差數較小，應用廣泛，缺點是操作煩瑣、周期長，不適用于微量組分分析。

3 結論與展望

隨著人們生活水平的日益提高，對食品安全的要求也隨之增加，從而對食品中亞硝酸鹽的準確檢測也提出了更高要求。目前用于食品中亞硝酸鹽的各種分析檢測方法在操作方法、準確性及靈敏度等方面各有優劣，其中光度法、色譜法仍是應用最廣泛的方法，其它大部分方法未能標準化，還不能滿足日常生活中實際樣品的檢測需要。但隨著分析試劑和儀器的發展，許多檢測方法的實用性和適用性都在增強。在今后的研究中，還需要進一步提高亞硝酸鹽檢測方法的簡便性、高效性和準確性。可以通過研發對亞硝酸鹽更靈敏的顯色劑或活性更高的催化劑，解決光度法中靈敏度較低的問題；通過探索更有效的提取、分離技術，色譜-光譜等多種分析方法聯用，實現食品中的亞硝酸鹽等多種組分的快速、同時測定；通過研制高效、穩定的修飾電極，增強電化學傳感器的穩定性和靈敏度，擴展其應用范圍。此外，各種食品在檢測前的預處理會直接影響檢測結果，目前雖然已有較為統一的前處理方法，但其步驟仍較多，處理時間較長，也有研究結合固相萃取等技術縮短了處理時間，但仍有待簡化增效。