淺析外泌體參與針刺調節作用的特點分析*

王美娟 ，李檸岑 ，陳波 ，2，3，陳勇 ，楊克儉 ，張靖宇 ，單凱 ，陳澤林 ，2，3，郭義 ，3，4

（1.天津中醫藥大學實驗針灸學研究中心，天津 301617；2.天津中醫藥大學針灸推拿學院，天津 301617；3.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381；4.天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617）

針灸是中醫的重要組成部分，也是世界衛生組織（WHO）認可的安全高效療法，目前已在世界近200個國家和地區使用，可治療百余種病種[1]。不同于西藥單一靶向的耦合反應，針灸療法可從整體層面和宏觀角度來調節機體狀態，產生廣泛而長遠的療效。針灸作為一種良性應激源刺激，具有不同于藥物的特點，它不是“點-點”直接針對病原體及患病的組織器官，而是通過啟動內源性自穩調控系統“神經-內分泌-免疫網絡”（NEI network）對機體發揮多水平、多系統、多靶點的調節作用。

過往針灸基礎研究多關注于“干預-效應”兩點之間的線性關系，忽略針灸作為復雜干預產生的整體網絡調節作用，嚴重制約了針灸學科的發展，使得基礎研究與臨床應用脫節，針灸科研成果轉化不足。

外泌體是一種由細胞釋放的直徑約30～200 nm的膜性囊泡，作為機體網絡聯系的重要載體與運輸方式，可以參與機體多種生理病理過程[2-3]。前期通過實驗研究[4]發現，針刺可調節外泌體釋放，且外泌體與針效之間存在密切關系，外泌體作為神經、內分泌、免疫細胞間相互通訊的重要載體，可能在針刺網絡調節中發揮重要作用。對外泌體的特點進行總結分析，發現外泌體來源分布廣、運載物質多、產生效應多，并可靶向與細胞結合，運載與疾病相關的靶標物質，臨床應用安全穩定，可能與針刺作用密切相關[5]。它獨特的生理學結構與功能，在針刺信息傳遞中具有很多優勢，為實現針刺信息在體液途徑遠距離、精準靶向傳遞提供了生物學基礎。因此筆者從外泌體入手，探究其生物學功能，整理分析外泌體與針刺作用特點的相關性，以期更好地揭示針灸作用機制和促進臨床轉化。

1 外泌體可能是針刺整體及網絡調節的重要載體

外泌體于1987年由Johnstone首次在成熟的哺乳動物網織紅細胞中發現[6]。幾乎所有活細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體，如間充質干細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、人羊膜上皮細胞、內皮祖細胞等不同類型的細胞[7]。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷而形成的多囊泡體，在多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中，且外泌體在體液中的分布十分廣泛，研究發現[8-10]唾液、心包積液、乳汁、尿液、腹水、羊水、腦脊髓液和血液等多種體液中都存在著外泌體。外泌體運載物質種類豐富，包含有蛋白質如細胞骨架蛋白、信號轉導相關蛋白、代謝酶類、抗原結合提呈相關蛋白等共9 769種，核酸組分mRNA、miRNA、IncRNA、mtRNA、circRNA 等6246種，脂質組分如鞘磷脂、磷脂類、神經酰胺和三酰甘油等共1 116種[11]。以肥大細胞為例，僅肥大細胞來源的外泌體就可以運載高達1 988種蛋白質，397個lncRNA和272個miRNA[12]。

整體性是中醫核心理論整體觀念的具體表現，針灸作用也具有整體性的特點，臨床研究和動物實驗表明，針灸可以調整呼吸、消化、循環、泌尿、神經、內分泌、免疫等各系統的異常功能，針灸對某一臟器的調整作用是通過對該臟器所屬系統甚至全身系統功能多層次、多水平的總體調節而實現的，從穴位至全身，由點及面，通過刺激體表腧穴達到調節機體整體狀態的作用[13]。針灸作用于穴位后，首先激活針灸穴位微環境小網絡，使針灸信息在穴位局部啟動并級聯放大，進而調動人體自身調節大網絡——NEI network，經調控，針灸效應信息輸出到靶器官，調整疾病網絡，產生針灸療效，三網聯動，糾正疾病的失衡狀態，恢復機體的內穩態，達到“中和”狀態[14]，產生針灸的整體調節作用。以NEI network為基礎的經絡網絡調控系統是人體維持自穩態的生物學基礎，是機體網絡調節的核心環節。神經系統是經絡系統的核心部分，同時還涵蓋了包括血液、淋巴、內分泌、免疫等等多系統的內容，是由多系統構成的一個多水平、多層次、多靶點的網絡體系。

著眼于臟腑功能的整體變化，而生命活動的內在本質是細胞活動，整體宏觀與微觀局部密不可分，微觀的動態變化也往往反映整體的變化。外泌體產生異常的蛋白質、分子等靶基因，提示人體內部微環境發生動態變化，進而表現出不同的癥狀。外泌體無所不在、無處不去的普適性特點也可能為針刺穴位信息的廣泛性提供一定支撐，如外泌體可攜帶多種靶向物質以血液、淋巴循環等方式到達肝臟、脾臟等多個臟器發揮相應的治療作用。同時以電針足三里穴治療佐劑性關節炎大鼠為研究平臺[15]，重點關注血清外泌體及內含物的變化，以神經內分泌網絡為切入點，以蛋白組學為重要手段，從總體上把握疾病狀態針刺前后血清外泌體及其內含物的整體變化情況，抓兩頭看中間，結合海量的蛋白組學數據以及復雜網絡分析篩選出針刺后關鍵信號蛋白和重要通路，探討電針治療佐劑性關節炎鎮痛抗炎的作用規律[16]。同時發現針刺血清外泌體運載蛋白存在時效、量效差異變化，可能作為具有潛在的針灸廣譜性效應物質，產生小刺激、大反應的效應。外泌體及其內含物質作為神經、內分泌、免疫等細胞間相互通訊的重要載體，可能在針刺信號傳導過程中發揮重要作用，為針刺的整體、網絡調節提供生物學基礎。

2 外泌體的靶向運輸為針刺的“氣至病所”提供生物學基礎

外泌體在生物體中的細胞間交流發揮重要作用，其所攜帶的大量蛋白質、脂質以及核酸等生命信息需遵循生物體運行的有序性，否則會導致信息傳遞的錯亂，破壞生物體內平衡，故外泌體在體內的運輸具有一定的靶向性[17]。研究表明，在外泌體表面有一種“郵政編碼”—整合素，可以使外泌體去特定器官進行累積，改變其微環境進一步在相應部位發生轉移[18]。現代研究發現不同細胞分泌的外泌體擁有不同的整合素類型，從而在運輸過程中靶向不同的器官，影響特定器官轉移前微環境的形成，因此外泌體可能具有天然的靶向特定組織的特性，并且可以通過修改其生產細胞系重新改變其選擇性。如研究發現腫瘤可以向肝、肺等其他器官轉移，原因在于外泌體表面有不同的整合素，ITGα6β4及ITGα6β1這類整合素傾向于肺內組織移動，引起組織器官內蛋白水平的變化，產生炎癥反應，使成纖維細胞和間質細胞分化，重塑細胞外基質，誘導上皮間質轉化，引發血管生成，促進腫瘤的生長和轉移[19]。

現代研究發現，針刺可使腫瘤化療藥物導航聚焦，黃金昶團隊[20]發現針刺療法聯合紫杉醇在干預后能夠調節腫瘤微血管和微環境，使小鼠后瘤體紫杉醇濃度顯著增加，誘導腫瘤細胞凋亡。有學者提出可以運用針灸“靶向”思維輔助治療腫瘤或腫瘤相關癥狀，針刺穴位以引導化療藥物趨向靶病灶、調節預防和治療癌后的不良反應等[21]。針刺還可“以針促藥”治療皮膚損傷，臺灣大學研究所發現在治療大鼠糖尿病的皮膚傷口時，在傷口上用一種水凝膠生物材料聯合在傷口周圍針刺可使其達到（90.34±2.30）%的傷口閉合率，針刺通過激活補體C3a和補體C5a，增加細胞因子基質細胞衍生因子-1（SDF-1）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的分泌，以及下調促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素（IL）-1β，改善局部微環境，提高藥物利用率，從而加速組織再生，促進傷口愈合[22]。本團隊前期[23]通過非標定量法蛋白組學技術對針刺血清外泌體內含蛋白的分泌細胞或組織來源進行分析，發現這些蛋白主要存在于血漿、炎細胞、關節滑液、腦脊液、腺體組織和肌肉中，在病變部位表達含量的增加，可能與外泌體這一特性有關，推測外泌體可使關節局部微環境發生改變，以病變局部為需求，針刺有效成分靶向性移動，而“氣至病所”。同時外泌體是具有磷脂雙分子層結構的囊泡，其脂質密封結構可以保護相關信號分子在體內傳遞過程中不被降解，為遠距離靶向運輸提供穩定的生物學結構基礎，同時能保證外泌體在針刺信息傳遞過程中，將針灸刺激信號更加完整的傳導到網絡系統中，使針灸作用充分被機體調整和利用，實現遠距離靶向運輸[24]。

3 外泌體運載的特異性分子為臟腑-經穴相關提供研究思路

來源于不同的組織或細胞的外泌體有不同遺傳物質，其膜蛋白也有一定特異性，在實現細胞間信息交流的同時，同時也可間接反映母體細胞所屬器官和系統的生理病理狀態。如Laulagnier等[25]在肥大細胞分泌的外泌體中首先發現了具有肥大細胞特征的脂質。外泌體miR-301a在神經膠質瘤患者血清中表達升高，其升高程度與膠質瘤的病理分級具有相關性，反映了膠質瘤患者的腫瘤狀態和病理變化，提示血清外泌體miR-301a表達可作為膠質瘤診斷的新新型生物標志物，并作為晚期病變的預后因素[26]。另外結腸上皮細胞來源的外泌體膜表面多為A33蛋白，抗原提呈細胞來源-T細胞產生的外泌體表面多為MHCI、MHC-Ⅱ、CD86蛋白[27]。

“臟腑-經穴相關”為內臟器官生理或病理性的改變，可在體表有所反應；外界環境改變或人為刺激體表某些部位或穴位，也能引起相關內臟功能的改變，從而起到治療和調整作用。外泌體可攜帶特異性生物信息分子，全身廣泛分布，既能反映機體生理和病理的變化，又能作為治療疾病的靶點，與“臟腑-經穴相關”相似。如馬榮麗等[28]認為隨著腎功能的改變，由不同腎細胞分泌其外泌體，執行不同的生物功能來調控骨組織。每種外泌體都帶有特定的區分標志物，能靶向特定的位點，從多個方面分析“腎主骨”理論外泌體相關指標，認為這些指標可能是“腎主骨”理論的物質基礎，反映整個臟象功能。

4 針刺血清外泌體可為針刺基礎研究臨床轉化提供思路

外泌體自體分泌，免疫原性反應低，是一種安全穩定的藥物載體，同時還具有器官特異性分布的靶向特點，使得其向細胞的滲透能力提高，在提高藥物的利用度、延長藥物作用時間、實現藥物靶向定位以及降低藥物毒副作用等方面有一定潛在應用價值。與基于脂質體和基于聚合物的外源性藥物載體相比，外泌體由自體活細胞分泌，在生物相容性、免疫原性、穩定性、藥代動力學、生物分布和細胞攝取機制等方面顯示出許多優勢，是天然的轉運體，適于重復多次給藥，且不會造成治療性物質在肝臟的累積。且外泌體能將攜帶的遺傳物質直接傳遞進入細胞，有效避免被網狀內皮系統識別和清除，避免其在細胞外環境中被清除。目前，全球數十家公司正在研究開發改造外泌體的新技術，且已開始使用純凈的外泌體產品和工程化的外泌體產品進行臨床試驗。

外泌體在臨床上應用也逐漸廣泛，上海交大附屬醫院證實來自富血小板血漿的外泌體在糖尿病大鼠中通過激活YAP促進慢性皮膚傷口的上皮再形成[29]；在BALB/c小鼠的全層皮膚缺損傷口上，經血清外泌體處理后，小鼠傷口愈合可加快[30]。課題組前期研究發現對膿毒癥小鼠注入外泌體拮抗劑GW4869，抑制了電針治療膿毒癥小鼠的療效[31]，回輸正常小鼠電針后的血清外泌體，可產生“針刺樣”作用。腹腔回輸正常大鼠電針后的血清外泌體對佐劑性關節炎大鼠也明顯的鎮痛效應[32]，提示血清外泌體可作為一種生物制劑進行開發研究。

5 小結

外泌體分布廣、來源廣、運載物質多、產生效應多、靶向運輸、組織來源特異性、臨床應用安全穩定等特點，可能與針灸整體網絡調節、“氣至病所”、臟腑-經穴相關、針灸血清藥轉化應用等特點密切相關。在針刺多水平、多途徑、多靶點的調節過程中，外泌體及其運載物質可能是重要的物質基礎，充分利用高通量組學技術與方法進行研究是打開針刺起效機制的重要途徑。但目前對于外泌體參與針刺調節的機制仍有待探索。針灸刺激會產生雙向良性調節，能對生理病理過程功能產生反向調節，所產生的效果取決于機體本身的表現，外泌體是否以及如何參與其中尚不清楚。以及網絡調節是針灸作用的最主要特點，雖然肯定了外泌體可能參與NEI network調節過程，但其作用機制是什么未來還需要進一步研究。來源于針刺血清外泌體的新藥發現與開發策略，可能為探索出從實驗室到臨床的轉化醫學模式，促進臨床療效最大化，提高針灸應用水平提供有力證據。