苗藥小花清風藤葉內生真菌Guignardia sp.次生代謝產物化學成分的分離和結構鑒定

李 婷，周永強，徐 慧，魏紫云，任佳霖，趙春麗*

（貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025）

小花清風藤Sabia parviflora Wall.exRoxb 為清風藤科清風藤屬的常綠木本藤本植物[1]，入藥部位包括根、莖、葉具有治療風濕性關節痛，腰痛，止血、止痛的作用。小花清風藤主要含黃酮類、生物堿、五環三萜、揮發性等成分[2-7]。已有的研究結果表明，長期的協同進化，使某些藥用植物內生真菌可以產生與宿主植物相同或相似的活性物質[8]。且不會引起宿主植物出現明顯感染癥狀。內生真菌除了具有間接或直接，協同或拮抗宿主植物個體合成有機化學物質能力，還能自身合成具有活性的化合物。目前，學者們的研究方向仍停留在小花清風藤的化學成分、藥理作用、臨床作用層面，對于其內生真菌的深入研究暫未報道。因此，從已發現的苗藥小花清風藤內生真菌Guignardia sp.（球座菌）活化后進行大批量發酵，并采用溶劑萃取法、柱色譜法等制備有效部位，進一步結合柱色譜的方法純化并結構解析單體化合物。對小花清風藤內生真菌進一步的開發利用，篩選活性物質，對保護維護小花清風藤生態環境與利用具有一定的科學意義。依托貴州中醫藥大學對小花清風藤內生真菌進行分離，在小花清風藤葉中分離出一株球座菌并命名為L-53?，F有相關研究表明，球座菌代謝產生的Meroterpenes、Dioxolanone 及它們的化學合成衍生物具有較好的抗真菌活性。裙帶菜中的球座菌能夠產生麥角甾醇類化合物[9]為更好地合理利用小花清風藤內生真菌資源，本文對Guignardia sp. 次生代謝產物進行了分離提取與結構確證。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

小花清風藤內生真菌菌株L-53 是從小花清風藤葉中分離得到，經鑒定為Guignardia sp.（球座菌屬），現保存于貴州中醫藥大學中醫藥大學生物制藥實驗室。

1.2 實驗儀器與試劑

甲醇、二氯甲烷、石油醚（天津市富宇精細化工有限公司），80-100 目/200-300 目柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司）；SHB-Ⅲ循環式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；FA2104N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司），DHG-9070B 智能型恒溫鼓風干燥箱（上?，樮帉嶒炘O備有限公司）；SB-600DTY 超聲波多頻清洗劑（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DLSB-5L/20 低溫冷卻液循環泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；N-1300 旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），UPTC-20 超純水機（閔測儀器設備有限公司），RE-5210A 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），HP-05 陶瓷封閉式恒溫電烤爐（上海學森儀器有限公司），DCD-642WEG 型冰箱（安徽康佳同創電器有限公司），01-5A 型烘干箱（杭州藍天儀器廠），18L 高壓滅菌鍋（貴陽凱信商貿經營部），Gilson 移液槍（吉而遜實驗儀器（上海）有限公司），LRH 型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 培養基的制備及發酵菌種的活化

取4.01 g 鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）粉末加入100 ml 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌20 min，滅菌后放入超凈臺紫外滅菌30 min，等待溫度將至85 ℃時分裝至培養皿中，等待冷卻備用。將保存在斜面培養基中的L-53，放于操作臺中，紫外滅菌30 min。雙手用75%酒精擦拭后進行操作，將要分離菌種的標本接種針用酒精燈灼燒滅菌2～3 次，冷卻后在標本上挑取微量菌種于冷卻后的平板上，平板倒置并用封口膜封口，在培養皿上寫上日期及菌種編號，將平板放置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～4 天。長期冷藏保存的菌種需經歷2～3 次活化完成復壯過程，活化后的菌種能更好的適應外界培養環境，為后期大規模發酵培養奠定良好基礎。

2.2 菌絲體的提取、分離與純化

菌株L-53 經復蘇后，與馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（Potato Dextrose Broth,PDB）一起放入超凈臺中滅菌30 min。將接菌環反復灼燒滅菌2～3 次，冷卻后將已經純化分離好的L-53 菌單個菌落挑出，并迅速伸入裝有液體培養基的錐形瓶與液面銜接處，上下滑動摩擦瓶壁，使孢子成功接入液體培養基中。接菌后再用透氣封口膜和棉繩封口。放入恒溫震蕩培養箱中培養3～4 d（28 ℃，150 r/min），獲得種子培養液。L-53 菌株用馬鈴薯培養基大規模發酵，發酵200瓶（每1000 mL 的三角錐形瓶中加入200 mL 的培養液），在121 ℃的高溫滅菌鍋中滅菌20 min，待培養基冷卻后接種，室溫靜置發酵30 d。發酵產物使用布氏漏斗進行減壓抽濾將菌體發酵液和菌絲體分離，共得到菌體發酵液7.5 L，菌體鮮重80 g。將菌體浸入分析純甲醇中，在40 KHz 條件下超聲作用20 min 使細胞壁破碎，補充甲醇至料液比1:8，加熱回流提取三次，每次2 h，合并三次提取液，濃縮后得到總浸膏共5.2 g。按1:1.5 比例加入80-100 目硅膠進行拌樣，水浴揮干甲醇，濕法裝柱，干法上樣。用不同比例的二氯甲烷和甲醇進行梯度洗脫，依次以20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1、1:1、甲醇進行洗脫，分別命名共收集A-I共九個組分。

其中H 旋蒸濃縮后在樣品表面出現無色晶體化合物，用二氯甲烷:甲醇=1:1 溶劑重結晶析出得到透明無色結晶化合物1（15.62 mg）。向E 中樣品添加少量的二氯甲烷:甲醇=4:1 溶劑長期處于0 ℃條件下析出一白色結晶化合物，用極性較低的石油醚對晶體進行3 次潤洗得到的白色晶體化合物2（7.52 mg）。工藝流程圖見圖1。

圖1 小花清風藤葉內生真菌菌體成分提取、分離純化及鑒定工藝流程圖

3 實驗結果

3.1 D- 半乳糖醇的結構確定

化合物1 為透明無色晶體，易溶于熱水(1:2)，溶于冷水(1:30)，微溶于乙醇。分子式為C6H14O6。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)（表1）顯示δH：3.33-3.41 (4H,m)，4.32 (2H, t,J=4.52 Hz)，4.41 (2H, d, J=4.84Hz)，13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)（表1），δC：63.9(C-1,C-6)，69.7(C-2, C-5)，71.4(C-3, C-4)與已知文獻[10]對照，數據基本一致，故確定化合物1 為D- 半乳糖醇，其結構（圖2）。

圖2 化合物1 的結構

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數據(CD3SOCD3)

3.2 丙三醇的結構確定

化合物2 低溫下呈現白色晶體（丙三醇長期放置于0 ℃低溫處，能形成熔點為17.8 ℃的白色結晶）[12-13]，常溫狀態為無色澄清狀粘稠液體。可混溶于乙醇，與水混溶，不溶于氯仿、醚、二硫化碳、苯、油類。分子式為C3H8O3。

根據1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）（表2）顯示δH：4.28-4.48 為羥基氫，3.30-3.40（2H，m），3.49-3.58（4H，m），在13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）（表2）中δC：63.3（C-1, C-3），72.6（C-2）。

表2 化合物2 的1H-NMR 和13C-NMR 數據（CD3SOCD3）

以上波譜數據與文獻[11]基本一致，故確定化合物2 為丙三醇（圖3）。

圖3 化合物2 的結構

4 結論與討論

小花清風藤具較高的藥用價值和臨床價值，但小花清風藤資源分布少。目前人們獲取臨床所需藥物主要是通過合成、半合成或從藥用植物中提取。化學合成藥物存在收率低、污染大、副產物多等弊端，而直接從藥用植物中提取有效成分也受許多因素的限制。近年來，內生真菌及其次生的代謝產物研究都有明顯進步，微生物發酵具有成本低、易于培養、產量穩定、周期較段、易于調控等優點。本文應用正相硅膠柱色譜、重結晶1H-NMR、13C-NMR 等方法對小花清風藤內生真菌Guignardia sp. 菌絲體的甲醇提取物的化學成分進行了系統研究，從部位中分離得到了2 個化合物，并應用理化性質、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜對其進行結構確證。對小花清風藤內生真菌進一步的開發利用，篩選活性物質，對保護維護小花清風藤生態環境與利用具有一定的科學意義。