醬油發酵過程中生物胺生成影響因素及其調控研究進展

劉威，董浩，曾曉房，白衛東，于立梅*

(1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣州 510225；2.廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，廣州 510225；3.農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣州 510225)

醬油是起源于我國的一種傳統發酵調味品，在日常烹飪中發揮著調味、調色、增鮮、增香的重要作用。醬油是利用發酵微生物將高蛋白質的植物性原料(豆類，以黃豆為主)分解為眾多的氨基酸、有機酸等物質，再經過復雜的化學反應和各類代謝途徑形成的具有豐富營養物質和獨特風味的調味液。

由于微生物和非生物化學反應，醬油釀造過程中會出現氨基酸脫羧或醛轉氨現象，產生不良化合物生物胺(biogenic amines， BAs)。BAs具有生物活性，與人體健康息息相關。攝入含有高濃度BAs的食物可能會對人體造成不良毒理學影響甚至產生癌細胞[1]。目前國內外學者對醬油的研究主要集中在醬油BAs的檢測[2-4]、調控[5-6]以及品質[7]等方面。本文對BAs的產生機理、生成因素、調控方法進行系統的歸納總結，旨在為科學生產醬油、減少醬油中BAs的生成、調控等提供參考。

1 醬油中生物胺的形成機制

BAs是在食品長期發酵中產生的低分子量含氮有機化學物質。醬油發酵過程中蛋白質在曲霉等微生物的作用下被分解為游離氨基酸和小分子肽，同時代謝出氨基酸脫羧酶氨，使氨基酸發生脫羧反應，導致BAs的產生。因此，在BAs形成過程中，以下因素發揮作用：微生物——分泌促使氨基酸脫羧的酶；前體物質——原料中蛋白質被分解后的游離氨基酸；環境需求——滿足微生物生長、脫羧酶活性以及脫羧反應的條件。生物胺的合成有兩種途徑：一是氨基酸的脫羧作用，包括丙酮酰基團脫羧機制和磷酸吡哆醛脫羧機制；二是酮和醛的轉氨和胺化作用。

1.1 醬油中BAs種類

各種發酵醬油中BAs的類型和含量并不一致，其中酪胺是醬油中含量最豐富的BAs，醬油中常見的BAs見表1。按照不同的分類標準，BAs有不同的分類，BAs的分類見表2。BAs作為食品被吸收進人體后，不同的BAs發揮著不同的生理作用。

表1 醬油中8種生物胺基本信息Table 1 Basic information of eight biogenic amines in soy sauce

表2 生物胺的分類Table 2 Classification of biogenic amines

1.2 醬油中產生BAs的微生物

動植物原料的使用是食品含有一部分BAs的原因，而微生物的合成作用則是BAs來源的重要原因。醬油的釀造就是微生物將固態蛋白質原料轉變為液態調味料的一個過程，微生物的存在決定醬油的形成。霉菌、細菌和酵母菌與BAs形成密切相關，但是并非所有微生物都能促進BAs的形成，大部分微生物缺乏分泌氨基酸脫羧酶的能力。李巧玉[8]對高鹽稀態醬油醬醪中的魏斯氏菌進行分離，得到3種菌——融合魏斯氏菌、類腸膜魏斯氏菌和食竇魏斯氏菌，發現大部分魏斯氏菌缺乏合成BAs的能力，僅僅個別類腸膜魏斯氏菌能夠產生多種BAs。日本學者Ibe發現組胺是由Lactobacillussp.產生的，而酪胺是由Enterococcusfaecium產生的，產生酪氨的菌株是一種革蘭氏陽性球菌，并被鑒定為腸球菌[9-10]。Li等[11]的研究結果表明，BAs產生的關鍵在醬油制曲和發酵階段。在醬油前期發酵有賴于霉菌，在醬油發酵后期得益于乳酸菌和酵母菌。微生物菌種由于所產生的脫羧酶種類、數量、質量的差異，最終造成BAs的差異。在發酵過程中微生物菌群的變化也牽動著生物胺的變化，兩者相互關聯、密不可分。

2 影響生物胺形成的因素

2.1 原料

原料是影響BAs形成的一個基本因素。原料產地、種類、數量、質量等方面存在差異，為醬油中BAs的差異創造了條件。原料對BAs形成的影響主要包括以下幾個方面：第一，原料本身存在BAs，作為底物和反應的場所，參與其生成。Nout等[12]明確了原料中大豆的種類和比例影響發酵豆制品中BAs的含量。曹忠娜[13]發現，與豆粕相比，黃豆可減少BAs的生成；第二，不同的原料因其營養構成不同，適合不同的菌群生存，形成不同的微生物群體，最終形成不同的BAs；第三，具有氨基酸脫羧酶活性的假單胞菌、腸球菌、腸桿菌等細菌會污染處理前的原料，增加BAs生成幾率。在發酵過程中，在這些細菌死亡后仍伴隨氨基酸脫羧酶活性，從而無法阻止BAs在發酵食品生產、貯存過程中的不斷累積[14]。因此，對釀造醬油的原料進行加工工藝和衛生管理把控，實行危害分析與關鍵控制點(HACCP)有利于降低BAs，減少BAs的生成。

2.2 鹽含量

食鹽對BAs的形成有雙重效果：一方面，食鹽的高滲透壓能阻礙產胺微生物的生長、繁殖；另一方面，影響細菌細胞膜上氨基酸脫羧酶的活性，導致其脫羧能力下降，從而降低發酵制品中BAs的積累。Kim等[15]發現隨著食鹽濃度的增加，BAs的含量隨之減少。也有研究發現，高鹽稀態醬油中將鹽含量提高至20%，可有效降低BAs的產生。但為了保證傳統醬油正常的咸度和風味，一般將鹽含量控制在16%～18%。其次，并不是鹽含量越高，BAs的含量就越低，兩者也不是負相關關系。因為在高鹽濃度下耐鹽微生物的氨基酸脫羧酶活性反而得以增強，有利于BAs的增加。鹽對于BAs產生促進作用還是抑制作用，取決于菌種對鹽的耐受程度。袁樹昆[16]采用較高鹽濃度生產魚醬油，發現細菌群落與低鹽度相比沒有明顯差異，優勢菌屬沒有明顯的變化。劉蕊[17]應用新型低鹽固態發酵工藝釀造醬油，減少了發酵使用鹽量，發現發酵組的8種BAs總量均不超過250 mg/mL,保證了醬油的品質安全。因此，鹽度的高低對于BAs含量的影響也是復雜的。

2.3 pH

pH是微生物生長和氨基酸脫羧酶活性的關鍵因素。有報道表明，pH值在3.0～6.0范圍內細菌最適宜產生脫羧酶[18]，脫羧酶活力在pH 為4.0～5.5之間最高。pH的降低一方面抑制微生物的生長，降低BAs的生成；另一方面增加氨基酸脫羧酶的生成量和增強其活性，促進BAs形成[19]。原因在于，在低pH環境下，為了抵抗外部酸度環境，細菌產生更多的BAs。在醬油初始發酵階段，發酵液的pH約為6.5，耐酸微生物占優勢，代謝能力增強，氨基酸脫羧酶活性提升，促使大量游離氨基酸釋放出來，為BAs的形成提供了條件[20]。因此，在pH影響下，微生物與脫羧酶相互作用貫穿醬油整個發酵過程，最終決定BAs的含量。

2.4 溫度

溫度對醬油中微生代謝物和酶活性都有影響。大部分微生物、蛋白水解酶以及氨基酸脫羧酶在低溫(≤5 ℃)或高溫(≥40 ℃)條件下都難以正常活動，因此BAs的合成受到影響；而在20～37 ℃溫度條件下則有利于BAs的積累。 Eleonora等[21]發現在30～37 ℃酪氨酸脫羧酶脫羧力度最強。目前釀造醬油的兩種發酵方式中，低鹽固態釀造采取的發酵溫度≥35 ℃，而高鹽稀態釀造選擇的發酵溫度一般在28～30 ℃之間。研究表明，高溫條件有利于增加BAs的生成[22]。目前醬油的釀造主要采取高鹽稀態發酵方式，如何在保證醬油風味和品質的前提下，致力于低溫發酵醬油生產和改善低鹽固態發酵中存在的問題是未來醬油研發的方向。

3 醬油中生物胺的調控措施

根據影響BAs形成的途徑可以從游離氨基酸、微生物、氨基酸脫羧酶活性以及降解菌4個方面對BAs進行控制。

3.1 控制醬油中游離氨基酸的含量

游離氨基酸是BAs的來源之一，也是重要的限制因子。游離氨基酸被氨基酸脫羧酶作用發生脫羧反應產生BAs。某種程度上，BAs的種類和數量取決于游離氨基酸的種類和含量，兩者呈正相關[23]。游離氨基酸是反應的前體物質，減少游離氨基酸含量能夠達到降低BAs合成量的結果。Wang等[24]研究表明，在一定范圍內提高溫度，適當降低鹽含量有利于促進蛋白酶的水解活性，加快了對蛋白質的分解，推動了游離氨基酸的累積，利于生物胺的生成。但是氨基酸的種類、數量和原料的蛋白質含量反映了醬油的風味、營養品質等關鍵指標，為了限制BAs的生成而控制游離氨基酸和蛋白質含量的措施缺乏可行性。López-Rituerto等[25]發現葡萄酒發酵中利用酵母可實現由組氨酸到組氨醇的轉變，Yerlikaya等[26]研究發現谷氨酰轉胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)能夠使蛋白質之間的氨基酸結合，從而無法被氨基酸脫羧酶利用。因此，對游離氨基酸的轉化過程施加影響，形成新的結合物，可為調控BAs合成開發一個新路徑。

3.2 調控醬油中的微生物

微生物是BAs形成的前提條件之一，缺乏產氨基酸脫羧酶微生物的參與，食物中的游離氨基酸無法形成BAs。因此，通過控制原有的產氨基酸脫羧酶微生物生長代謝活性而降低食品中BAs的含量，是目前控制BAs含量非常有效的方法。另外，改變微生物中的菌群種類、比例、數量，或者引進另外的微生物對于抑制BAs的生成也能夠起到非常好的效果。

Guo等[27]通過對不同耐滲透酵母菌株的聯合接種發現，Z.rouxiiCICC 1417和T.candidaCICC 1019聯合接種的BAs含量最低(89.43 mg/L)。Mohamed等[28]利用宏基因組學和宏轉錄組學研究在醬油發酵過程中香菜對微生物菌群和BAs的影響，發現醬油發酵過程中加入香菜改變了微生物菌群的組成，有效抑制了BAs的生成。Qi等[29]研究廣東醬油發酵過程中微生物群落對BAs含量的影響，發現接種QH-17和嗜鹽桿菌CGMCC 3792，苯乙胺、酪胺、組胺含量均顯著降低。Kim等[30]發現在韓國醬油(Cheonggukjang)發酵中蠟樣芽孢桿菌具備產胺能力，加入地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)使該菌株的含量從3～4 lg CFU/g降低到1 lg CFU/g以下，并且有效地降低了BAs的含量。由此可見，在醬油原本微生物體系中引入外源微生物，作為新型發酵劑，對原本產胺微生物菌株產生拮抗作用，可降低BAs的生成累積。這些結果表明，生物干擾是醬油發酵過程中減少和消除BAs的有效策略。

3.3 控制醬油中氨基酸脫羧酶活力

氨基酸脫羧酶是一類裂解酶，對氨基酸進行催化裂解使其脫去羧基，形成對應的胺。通過調節pH、含鹽量、溫度等因素可以控制氨基酸脫羧酶的活力。鄒陽等在醬油制曲時添加冰醋酸，成功地降低了醬油中精胺、亞精胺及組胺的含量。Liu等利用高效液相色譜(HPLC技術)，證明了鹽度在高鹽稀態醬油發酵中對降低BAs具有關鍵作用。pH、鹽度、溫度等與醬油中BAs的含量并不是單一的線性關系，它們屬于醬油本身的某種特性，改變這些因素將對醬油的品質和風味造成影響。因此，采用單一調節某一個因素的方法抑制酶活性的措施并未得到廣泛的應用。目前，更多的研究通過優化組合來控制氨基酸脫羧酶活力，達到調控BAs生成的目的。曹忠娜等在高鹽稀態醬油制作過程中，既將發酵溫度降低到約20 ℃，又將鹽的含量提高到20%，有效降低了BAs生成總量。Li等研究得出在原料(DSW)、制曲環境(密封曲機)、發酵溫度(38 ℃)、氯化鈉(19%)、發酵時間(40 d)的條件下釀造的醬油的BAs得到有效抑制，同時特征營養素沒有丟失。另外，Qiu等[31]研究豆腐乳在成熟過程中，添加乙醇的豆腐乳總BAs含量明顯降低，推測乙醇對BAs的抑制作用機制可能是乙醇抑制了豆腐乳中脫羧酶活性。

3.4 提升醬油中BAs的降解水平

除了在源頭上阻止BAs的生成外，降解已經存在的目標產物的BAs也是一個有效的調控方法。生物胺氧化酶(amine oxidases，AOs)由BAs降解菌株合成，能夠將BAs分解成相應的乙醛(acetaldehyde)、氨和過氧化氫(H2O2)。微生物菌株除了能產胺氧化酶，還必須保證不具有產氨基酸脫羧酶活性，只有滿足這兩個條件才能用來降解食品中的BAs。程淑敏等[32]將BAs降解菌Wickerhamomycesanomalus和Millerozymafarinosa作為發酵劑接種至醬油發酵醪中，結果表明BAs被得到有效的降解。楊明泉等[33]將從醬醪中篩選獲得的一株嗜鹽片球菌擴大培養后，添加到以高鹽稀態工藝釀造的醬油的醬醪中，結果發現酪胺含量下降了77.00%，色胺含量下降了100%。符姜燕等[34]證實了從低生物胺醬醪中篩選出的一株嗜鹽四聯球菌在正常生長發育過程中無法產生BAs。張雁凌等[35]在低鹽醬油發酵過程中添加嗜鹽四聯球菌 TS71和魯氏酵母A22，發現低鹽醬油的BAs降低了3.42 mg/kg。Cheng等[36]從一些自然發酵食品樣品中分離出異常威氏鐮刀菌和法氏鐮刀菌。在一定條件下該菌株表現出較高的多重BAs降解活性。藍翔等[37]將兩株BAs降解菌EnterococcusfaeciumR7和MillerozymafarinoseA3接種到發酵魚露中，發現接種復合降解菌的降解能力強，生物胺降解菌的聯合接種為抑制BAs合成提供了一個新路徑。

4 總結

醬油是中國的傳統調味品，但是醬油中的BAs存在超標的情況，因此對釀造醬油中BAs的形成機理以及調控方法進行研究對于提升醬油的品質，保證民眾的健康顯得尤為重要。了解BAs在醬油中的生成機理以及影響因素才能夠深入挖掘抑制BAs形成的方法。在生物胺形成的過程中離不開微生物、酶活性、原料的成分、反應的環境等諸多因素的作用，由于這些因素在發酵過程中并不是獨立作用的，而是相互影響，因此BAs的調控需要綜合考慮，在實現醬油中BAs的有效降低和不損害醬油的品質中找到一個平衡點。