陳皮精油的提取工藝優化及其抗氧化研究

常春梅，黃玉琴，竇媛，楊睿，段冰，杜華英，朱麗琴,2*

(1.江西農業大學 食品科學與工程學院，南昌 330045；2.江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，南昌 330045)

柑橘是世界第一大類水果，2019年，我國柑橘種植面積達2617.3 khm2，柑橘產量達4587.5萬噸[1]。我國是柑橘生產大國，擁有極豐富的地方良種資源、野生資源、野生近緣資源及天然雜種資源[2]。柑橘果實富含對人體有益的有機酸、膳食纖維、維生素、蛋白質、多糖等營養物質[3]，深受消費者的喜愛。目前對于柑橘的消費方式主要有鮮食和加工柑橘汁、罐頭兩種方式，這兩種加工方式都會產生大量的果皮?，F階段，很多柑橘加工企業仍以簡單衛生填埋為主要的處理皮渣方式[4]。柑橘皮渣中含有黃酮[5-6]、精油[7-8]、果膠[9-11]、膳食纖維[12-13]等多種生物活性物質，如果不對其進行加工利用，勢必造成對原料的浪費，不利于柑橘深加工產業的發展。另外，將柑橘皮渣直接丟棄于環境中會造成污染，不利于環境的綠色可持續發展。因此，利用柑橘皮渣不僅可以減輕環境負擔，有利于環境的可持續發展，還可以從中提取生物活性物質，有利于醫療、食品、化妝品等行業的發展。陳皮(Citrireticulataepericarpium，CRP)為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮[14]，陳皮中含有140余種化合物，具有廣泛的藥理學效應，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，作為一種藥食兩用品種，被廣泛應用于醫藥行業和日常生活。其中，揮發油和黃酮類化合物通常被認為是主要的生物活性物質和特征成分[15]。陳皮的出現對于減少柑橘皮對環境的污染、增加柑橘產業附加值、促進柑橘產業的深加工發展起到了重要作用。

精油是一種復雜的混合物，通常具有強烈的感官特性和揮發性，是許多植物都可以產生的次生代謝物，也被稱為揮發油[16]。植物精油的來源廣泛，可以來源于根、莖、葉、花、果實、種子等各個植物器官，普遍具有抗氧化、消炎、抑菌、抗病毒等功效，具有較高的研究價值[17]。近些年來，健康、安全、天然的產物越來越受到人們的青睞，科研人員也積極尋求更安全健康的天然產物、更科學有效的方式來為人們的生產生活服務?，F階段從植物中提取精油的方法包括壓榨法、有機溶劑萃取法[18]、水蒸氣蒸餾法[19-20]、酶解法[21-22]、超聲法[23]、微波法[24]、超臨界CO2萃取法[25]等。上述方法各有其局限性，應根據實際需要選擇合適的提取方式。壓榨法是一種非熱處理的物理方法，可以較大程度地保留植物組織中的熱敏成分，但其無法較完全地將精油提取出來，造成原料利用不充分，精油產率不高，并且所提取的精油中含有的雜質較多，且不容易分離，品質較差。有機溶劑萃取法是通過相似相溶原理從植物組織中將精油提取出來，其提取原理容易造成有機溶劑的殘留，危害人們的健康。超臨界CO2萃取法提取率高，但其需要真空的提取環境及昂貴的生產設備，生產成本較高，因此現階段大多處于試驗階段，不適合工廠大型加工，并未大規模推廣?；谝陨峡紤]，故本文采用超聲破碎復合纖維素酶酶解優化陳皮精油的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮絲：新鄉市鳳泉區千尋花茶店；纖維素酶、無水Na2SO4、95%乙醇、過硫酸鉀(均為分析純)、ABTS+·：上海麥克林生化科技有限公司；DPPH·：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器設備

SB-3200DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；揮發油測定器、1000 mL圓底燒瓶、2 kW電爐 滬興電熱電器廠；冷凝管、電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；WFJ 2100可見分光光度計 尤尼科(上海)科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

陳皮絲→烘干→稱量→加酶、加蒸餾水→酶解→超聲→蒸餾→收集→無水Na2SO4除水→稱量→計算、記錄數據。

1.3.2 單因素試驗設計

以50.00 g陳皮絲為試驗原料，固定蒸餾水的量為300 mL，于不同纖維素酶添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、不同酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)、不同酶解時間(30，60，90，120，150 min)、不同超聲功率(50%、60%、70%、80%、90%)、不同超聲時間(10，20，30，40，50 min)的條件下，采用揮發油測定器提取3 h，至上層油含量不再發生變化，收集，加入適量無水硫酸鈉，靜置干燥，將得到的陳皮精油放入棕色瓶中，將棕色瓶放入4 ℃冰箱中備用。以陳皮精油的提取率作為指標進行評價，確定最佳條件，試驗重復3次。

1.3.3 精油提取率

陳皮精油提取率(%)=所得精油質量/物料質量×100%。

(1)

1.3.4 正交試驗設計

首先通過單因素試驗結果確定各單因素的最優水平，參照L18(37)正交設計優化陳皮精油提取條件，進行五因素三水平正交試驗設計，具體因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Design of factors and levels of orthogonal experiment

1.4 抗氧化能力測定

1.4.1 DPPH·清除率測定

參照文獻[26]的方法并加以改進。操作方法：用95%的乙醇將陳皮精油配制成濃度為320 mg/mL的母液，將一定體積的陳皮精油母液與1 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液混合，并用95%的乙醇將反應體系補充至2 mL,混勻，避光反應30 min后，在517 nm波長處測定其吸光值，記為A1；以95%乙醇溶液為空白對照，測定1 mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液與1 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值，記為A0。自由基清除率按公式(2)計算：

DPPH·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

(2)

1.4.2 ABTS+·清除率測定

采用文獻[27]的方法并略作改進。將7 mmol/L溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，置于暗處12～16 h，用95%乙醇將ABTS+·溶液稀釋至在波長734 nm處的吸光值為0.70±0.02。將提取的陳皮精油樣品用95%乙醇配制成質量濃度為80 mg/mL的母液，取一定體積母液與1 mL ABTS+·溶液混合，并用95%乙醇補充反應體系至2 mL，搖勻后靜置10 min，在波長734 nm處測吸光值，記為A1；以95%乙醇溶液為空白對照，測定1 mL ABTS+·溶液與1 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值，記為A0。自由基清除率按公式(3)計算:

ABTS+·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

(3)

1.5 數據處理

本試驗重復3次，采用SPSS 20.0進行數據分析，采用新復極差法(Duncan's)進行顯著性分析(P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異)，采用Origin軟件進行繪圖處理。

2 結果分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 纖維素酶添加量對陳皮精油提取率的影響

固定酶解溫度為45 ℃，酶解時間為90 min，超聲功率為70%，超聲時間為30 min，研究纖維素酶添加量對陳皮精油提取率的影響，結果見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對陳皮精油提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition amount on the yield of CRP essential oil

由圖1可知，纖維素酶添加量較少時，陳皮酶解不完全，隨著纖維素酶添加量的增加，陳皮酶解程度增大，越來越多腺體內的精油被釋放出來，陳皮精油提取率上升。當纖維素酶添加量超過4%時，陳皮酶解完全，再增加纖維素酶添加量，纖維素酶會吸附部分果皮溶出物，造成精油提取率下降。

2.1.2 酶解溫度對陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解時間為90 min，超聲功率為70%，超聲時間為30 min，研究酶解溫度對陳皮精油提取率的影響，結果見圖2。

圖2 酶解溫度對陳皮精油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of CRP essential oil

由圖2可知，在不同溫度下對陳皮絲進行酶解，前期酶解溫度的上升會促進精油的釋放，此時精油的揮發量遠遠小于酶解溫度的升高對陳皮精油產率的影響，因此隨著酶解溫度升高，陳皮精油的提取率逐漸升高。在45 ℃條件下水解一定時間，陳皮精油的提取率達到最大值。溫度進一步上升會對酶活性產生一定影響，造成陳皮酶解不完全，精油的提取率有所下降。

2.1.3 酶解時間對陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，超聲功率為70%，超聲時間為30 min，研究酶解時間對陳皮精油提取率的影響，結果見圖3。

圖3 酶解時間對陳皮精油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of CRP essential oil

由圖3可知，在最適酶解溫度條件下對陳皮絲酶解不同時間，在30～120 min內，隨著酶解時間的延長，纖維素酶酶解陳皮的程度逐漸增大，因此陳皮精油的提取率逐漸升高，在45 ℃條件下水解120 min時，陳皮精油的產率達到最大值。但再增加酶解時間，增加的精油產量不足以補充時間延長造成的精油揮發損失，因此精油提取率下降。

2.1.4 超聲功率對陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為120 min，超聲時間為30 min，研究超聲功率對陳皮精油提取率的影響，結果見圖4。

圖4 超聲功率對陳皮精油提取率的影響

由圖4可知，當超聲波功率為50%～80%時，超聲波功率的逐步增大會破壞陳皮的組織，使更多的陳皮精油釋放出來，精油提取率逐漸升高，并于超聲功率達到80%時達到最大值。但功率再增大會造成超聲機內溫度升高，使精油提取率下降。

2.1.5 超聲時間對陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為120 min，超聲功率為80%，研究超聲時間對陳皮精油提取率的影響，結果見圖5。

圖5 超聲時間對陳皮精油產率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of CRP essential oil

由圖5可知，超聲時間在10～40 min內，超聲時間的延長可以更徹底地破碎細胞壁，使精油更大程度地釋放，陳皮精油的提取率隨著超聲時間的延長不斷上升。但隨著超聲時間的繼續延長，超聲機內溫度上升，會加快精油釋放到空氣中，造成精油產率下降。因此，超聲時間超過40 min時提取率有所下降。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，參照L18(37)正交表，進行五因素三水平正交試驗設計，對影響陳皮精油提取率的各因素進行正交試驗。正交試驗結果分析見表2，正交試驗方差分析見表3。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

經正交結果分析，5個因素對陳皮精油產率影響的主次順序為纖維素酶添加量>超聲功率>酶解時間>酶解溫度>超聲時間，且產率最高的組合為A2B2C2D2E2，即纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為120 min，超聲功率為80%，超聲時間為40 min。因其未在正交表中，后期進行驗證試驗，產率達0.69%。正交表中最高組合A3B2C3D2E1的產率為0.6415%，驗證試驗的精油產率高于正交試驗的最高組合。不利用超聲和酶解方式輔助提取的情況下，精油的產率為0.34%，僅為超聲波和酶法輔助提取的1/2，表明超聲波輔助酶法提取陳皮精油的方法可行。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

續 表

2.3 陳皮精油抗氧化能力分析

2.3.1 陳皮精油對DPPH·清除率的影響

陳皮精油對DPPH·清除率的影響見圖6。

圖6 陳皮精油對DPPH·清除率的影響

由圖6可知，陳皮精油濃度較低時，隨著濃度的增大，對DPPH·的清除率呈明顯上升趨勢。當陳皮精油濃度為40 mg/mL時，清除率達到70%，之后繼續增加精油濃度，DPPH·清除率趨于平緩，最高可以達到82%左右。說明陳皮精油對DPPH·具有良好的清除效果。

2.3.2 陳皮精油對ABTS+·清除率的影響

陳皮精油對ABTS+·清除率的影響見圖7。

圖7 陳皮精油對ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effect of CRP essential oil on the scavenging rate of ABTS+·

由圖7可知，陳皮精油濃度較低時，隨著濃度的增大，對ABTS+·的清除率呈明顯上升趨勢。當陳皮精油濃度為10 mg/mL時，清除率達到74%，之后增加精油濃度對ABTS+·清除率的影響不大，其對ABTS+·的清除率基本保持在80%左右。說明陳皮精油對ABTS+·具有良好的清除效果。

3 結論

本試驗采用超聲破碎復合纖維素酶酶解法提取陳皮中的精油，優化超聲輔助酶法提取陳皮精油的提取條件。正交試驗結果確定纖維素酶添加量4%、酶解溫度45 ℃、酶解時間120 min、超聲功率80%(640 W)、超聲時間40 min為陳皮精油的最佳提取條件。方差分析結果表明，纖維素酶添加量對陳皮精油提取率影響極顯著，超聲功率對陳皮精油提取率影響顯著。經正交優化，超聲輔助酶法提取陳皮精油的產率為0.69%。經此方法提取的陳皮精油具有良好的抗氧化效果。因此，超聲輔助酶法提取陳皮精油降低了生產成本且提取過程低碳環保，適合大規模生產，有一定的應用價值。