小兒肺咳顆粒中鱉甲DNA分子鑒定

蘇 園， 王立瑋， 焦兆群， 徐 超， 夏國(guó)華， 楊 歡*

(1.如皋市中醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

鱉甲為鱉科動(dòng)物鱉TrionyxsinensisWiegmann的背甲，性微寒，味咸，歸肝、腎經(jīng)，有滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅(jiān)散結(jié)[1]。鱉甲應(yīng)用廣泛，需求量大，市面上出現(xiàn)一些偽品，其中最為常見的是佛羅里達(dá)鱉Apaloneferox[2]。通過傳統(tǒng)的性狀、顯微及理化方法難以實(shí)現(xiàn)其中鱉甲的準(zhǔn)確鑒定。DNA分子鑒定特異性高，近年來發(fā)展迅速[3]。Hou[4]、劉曉帆等[5]分別利用COI barcoding鑒別海馬、水蛭，周辰杰等[6]通過PCR鑒別不同來源鹿血，黃巧麗等[7]采用ITS序列鑒定了四葉參內(nèi)生真菌為綠僵菌。2020年版《中國(guó)藥典》中烏梢蛇等采用DNA條形碼分子鑒定法，該技術(shù)要求COI序列保持完整，擴(kuò)增產(chǎn)物需要測(cè)序，操作步驟繁瑣，不適用于混合物。小兒肺咳顆粒中含有鱉甲和雞內(nèi)金2味動(dòng)物藥成份，經(jīng)過提取與純化后的DNA供試品無法通過COI條形碼鑒定其基原，而特異性引物擴(kuò)增是根據(jù)基因序列存在的差異所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，在檢驗(yàn)過程中無需測(cè)序，且抗干擾能力較強(qiáng)，適用于混合物，彌補(bǔ)了DNA條形碼技術(shù)的不足[8-11]。

根據(jù)鱉及佛羅里達(dá)鱉的線粒體全基因mtDNA序列的差異設(shè)計(jì)引物，基于特異性引物擴(kuò)增建立具有較強(qiáng)專屬性且能夠簡(jiǎn)便快速地檢測(cè)小兒肺咳顆粒中鱉甲方法，為成方制劑的質(zhì)量控制提供可靠的檢測(cè)方法，亦可為成方制劑中動(dòng)物藥的專屬性鑒定研究提供一條新的途徑。

1 材料

1.1 儀器 T-MS型混勻儀(美國(guó)Topscience公司)；AL104型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；5424型小型臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；TGL-16M型高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；NanoDrop 2000型核酸蛋白分析儀(美國(guó)Thermo公司)；LDZF-30L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；T100型PCR儀、Universal型電泳電源、Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；GenoSens 1860型凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品 基原動(dòng)物鱉和佛羅里達(dá)鱉分別于2016年11月購(gòu)自江蘇省鎮(zhèn)江市，并經(jīng)COI條形碼鑒定分別為鱉科動(dòng)物鱉TrionyxsinensisWiegmann和佛羅里達(dá)鱉Apaloneferox，憑證標(biāo)本號(hào)201611PS10和201611AF03；小兒肺咳顆粒處方中除鱉甲外其余21味中藥飲片(雞內(nèi)金、麥冬、黃芪、枸杞、膽南星、桑白皮、紫菀、款冬花、瓜蔞、淡附片、干姜、桂枝、青蒿、炙甘草、北沙參、地骨皮、酒大黃、陳皮、白術(shù)、茯苓和人參)均購(gòu)自鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，由該院藥劑科孫小祥主任中藥師鑒定為正品；10批小兒肺咳顆粒購(gòu)自各地藥房(表1)。乙醇、氯仿等(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。DNA提取酚試劑、dNTP Mix、DNA聚合酶、低電滲瓊脂糖、Tris-base、Proteinase K、Ethidium Bromide、Low DNA Ladder(北京索萊寶科技有限公司)；特異性引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 市售小兒肺咳顆粒信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顆粒制備 黃芪、地骨皮、北沙參、麥冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜萎、紫菀、桑白皮加水煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液，濃縮成相對(duì)密度為1.26～1.30(80 ℃)的清膏；其余粉碎細(xì)粉，與上述清膏及適量蔗糖混勻，制成顆粒，干燥后即得小兒肺咳顆粒(P1～P7)；此外，將鱉甲更換為佛羅里達(dá)鱉甲制成小兒肺咳顆粒偽品(F1～F7)；不加入鱉甲則制成陰性制劑(N1～N7)。

2.2 供試品溶液的制備 分別稱取小兒肺咳顆粒、偽品及陰性制劑各50.0 mg，加入2×CTAB提取液995 μL和2% β-巰基乙醇5 μL，混勻后置于65 ℃金屬浴，600 r/min下水平振蕩2 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液加入等體積預(yù)冷的70%甲醇，混勻后于-20 ℃下冷凍1 h，離心10 min，棄去上清液，沉淀中加入2×CTAB提取液495 μL和2% β-巰基乙醇5 μL，振蕩30 min，離心后取上清液，加入等體積酚-氯仿(1∶1)混合液，混勻后離心，上清液加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)混合液，混勻，再次離心，取上清液并加入等體積預(yù)冷異丙醇和3 moI/L KAc溶液100 μL，混勻后置于-20 ℃下冷凍1 h，離心后棄去上清液，沉淀中加入500 μL預(yù)冷的70%乙醇洗滌，常溫下晾干，殘留物以25 μL TE緩沖液溶解，制得DNA供試品溶液，260/280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 特異性引物的設(shè)計(jì) 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索下載鱉及佛羅里達(dá)鱉的mtDNA序列，并采用DNAMAN軟件比對(duì)兩物種的基因差異，然后以O(shè)ligo 7軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并通過NCBI Primer-BLAST評(píng)估，引物序列信息見表2。

表2 特異性引物

注：A為引物PP2，B為引物PA3。P1為自制正品制劑，F(xiàn)1為自制偽品制劑，N1為自制陰性制劑，M為DNA Ladder，B為空白對(duì)照。

2.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系由10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、正反向引物各0.5 μL、模板DNA(10 ng)1 μL、DNA聚合酶0.125 μL、MgCl22.5 μL，再加入無菌雙蒸水至25 μL，以鱉甲或佛羅里達(dá)鱉甲為陽性對(duì)照。擴(kuò)增后將產(chǎn)物載入2%TBE瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，觀察目的片段條帶。優(yōu)化退火溫度(圖1)，在各溫度條件下均未觀察到自制陰性制劑的擴(kuò)增條帶，表明除鱉甲外的其余飲片不影響特異性PCR擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度由56 ℃升高至60 ℃后，自制正品制劑的DNA經(jīng)引物PP2擴(kuò)增后產(chǎn)生較亮的條帶，但是自制偽品制劑DNA亦產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，而隨著溫度進(jìn)一步升高到62 ℃，則未觀察到非特異性擴(kuò)增條帶，因此選擇62 ℃為引物PP2擴(kuò)增時(shí)的最優(yōu)退火溫度。另一方面，當(dāng)退火溫度由56 ℃升高至60 ℃后，經(jīng)引物PA3擴(kuò)增后只觀察到特異性擴(kuò)增條帶；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，條帶亮度減弱直至無任何條帶，因此56 ℃被選擇為PA3擴(kuò)增時(shí)的最優(yōu)退火溫度。此外，優(yōu)化循環(huán)數(shù)，當(dāng)循環(huán)數(shù)為35次時(shí)(圖2)，市售小兒肺咳顆粒總DNA經(jīng)引物PP2或PA3擴(kuò)增后，電泳中有條帶出現(xiàn)，但是亮度較弱，為減少假陰性結(jié)果，選擇更高循環(huán)數(shù)40次。在此基礎(chǔ)上建立PCR擴(kuò)增條件(表3)。

注：P1～P3為自制正品制劑，F(xiàn)1～F3為自制偽品制劑，N1～N3為自制陰性制劑，XR1～XR3為市售小兒肺咳顆粒，M為DNA Ladder，B為空白對(duì)照。

表3 PCR擴(kuò)增條件

2.5 特異性及靈敏度考察 將不同批次的自制正品、偽品及陰性制劑按“2.2”項(xiàng)下方法制備DNA供試品溶液，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳分析，見圖3。自制正品制劑DNA經(jīng)引物PP2擴(kuò)增后僅在183 bp處觀察到擴(kuò)增條帶；自制偽品制劑DNA經(jīng)引物PA3擴(kuò)增后則僅在95 bp處產(chǎn)生條帶，表明本方法具有良好的特異性。

注：T為陽性對(duì)照，P1～P7為自制正品制劑，F(xiàn)1～F7為自制偽品制劑，N1～N7為自制陰性制劑，M為DNA Ladder，B為空白對(duì)照。

將自制正品及偽品制劑的DNA供試品溶液以10倍比稀釋，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見圖4。當(dāng)濃度稀釋至10、1.0、0.10 ng/μL時(shí)，經(jīng)引物PP2擴(kuò)增后可檢出鱉甲條帶；隨著濃度降低至0.010、0.001 0 ng/μL，未能檢出條帶。當(dāng)濃度由10 ng/μL稀釋至0.010 ng/μL時(shí)，經(jīng)引物PA3擴(kuò)增后可檢出佛羅里達(dá)鱉甲條帶；當(dāng)濃度降低至0.001 0 ng/μL，則無法觀察到條帶，表明引物PP2及PA3的檢測(cè)靈敏度分別為0.10、0.010 ng/μL。

注：A～E為10、1.0、0.10、0.010、0.001 0 ng/μL的模板DNA，M為DNA Ladder，B為空白對(duì)照。

2.6 市售小兒肺咳顆粒中鱉甲檢測(cè) 對(duì)10批小兒肺咳顆粒中鱉甲進(jìn)行檢測(cè)。分別精密稱取10批次的中成藥樣品粉末50.00 mg，按照“2.2”項(xiàng)下方法提取與純化DNA，在“2.4”條件下擴(kuò)增。由圖5和表4可知，有4批檢出鱉DNA，且未檢出佛羅里達(dá)鱉DNA，表明其含有的鱉甲為正品；另外6批則兩者DNA均未能檢出。此外，可檢出鱉DNA的4批小兒肺咳顆粒均來自于廠家B，而未檢出的6批則均來自廠家A。

3 討論

中成藥成分復(fù)雜，所含動(dòng)物藥成分的顯微特征通常較弱，鑒定難度較大。長(zhǎng)期以來對(duì)動(dòng)物藥的指標(biāo)性成分研究較少，常采用氨基酸測(cè)定、總蛋白質(zhì)測(cè)定等方法，缺乏專屬性鑒定手段。多拷貝mtDNA在加工產(chǎn)物中比單拷貝核DNA有更高的生存機(jī)會(huì)[12-13]，因而動(dòng)物藥飲片中留存的mtDNA較為豐富，可作為中成藥中動(dòng)物藥成分的鑒定依據(jù)。本研究使用常規(guī)的DNA提取與純化方法，并基于mtDNA種間差異設(shè)計(jì)的特異性引物能檢出小兒肺咳顆粒中鱉甲及其常見偽品的動(dòng)物基原。

注：T為陽性對(duì)照，XR1～XR10為市售小兒肺咳顆粒，M為DNA Ladder，B為空白對(duì)照。

表4 小兒肺咳顆粒的鑒定結(jié)果

據(jù)報(bào)道，除了佛羅里達(dá)鱉之外，鱉甲的偽品還曾出現(xiàn)過馬來鱉Doganiasubplana、斑鱉Rafetusswinhoei和緣板鱉Lissemysscutata等；其中以佛羅里達(dá)鱉在國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖較多，是一種常見食用資源，易于獲得，因而在研究過程中選擇該偽品基原開展研究。