靈芝益壽丸微生物限度檢查法的建立

孫華穎， 楊巧月， 劉 勤， 向 東

(1.云南省食品藥品監督檢驗研究院,云南 昆明 650106；2.昆明醫科大學海源學院,云南 昆明 650106)

云南擁有豐富珍貴的地方中藥和民族藥資源，為了保證其質量，必須建立專門的質量檢驗方法。但中成藥成分復雜，多種組方藥材含有抑菌物質，常規微生物限度檢測法極容易出現假陰性，從而發生微生物污染漏檢的情況。

藥品微生物限度檢查可反映非無菌制劑中原輔料、生產工藝、運輸、儲藏等受到微生物污染的程度，是藥品生產和質量控制的重要手段[1]。為了確保中藥臨床使用的安全性，2020年版《中國藥典》[2]對口服制劑的微生物污染情況制定了具體的管理規定和控制要求。

靈芝益壽丸是云南省名老中醫羅銓教授的經驗方，主要由靈芝、制何首烏、人參、三七、當歸等藥材組成[3]，查閱文獻[4-8]發現，方中部分成分具有抑菌作用，但目前尚無其微生物限度檢查方法的報道。因此，本實驗建立了適合靈芝益壽丸微生物限度檢查的方法，以期為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 藥物 靈芝益壽丸由云南省中醫醫院提供，批號20190748、20191124、20191125。

1.2 培養基及稀釋劑 胰酪大豆瓊脂培養基TSA (批號200223)、胰酪大豆胨液體培養基TSB(批號2003062)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基SDA(批號2101062)均購自北京三藥開發公司。

1.3 菌株 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、沙門菌[CMCC(B)50094]均購自中國食品藥品檢定研究院，經專家進行理化特性鑒定后均符合試驗要求。

2 方法

2.1 菌液制備 將“1.3”項下菌株按照相關要求制成適宜濃度的菌懸液，使試驗時終濃度不大于100 cfu/mL[9-16]。

2.2 供試液制備

2.2.1 不含中和劑 取丸劑10 g，加入胰酪大豆胨液體培養基至100 mL，制成均勻的1∶10供試液，取5 mL加入胰酪大豆胨液體培養基至10 mL，制成均勻的1∶20供試液；另取2 mL，加入胰酪大豆胨液體培養基至10 mL，制成均勻的1∶50供試液，即得。

2.2.2 含中和劑 取丸劑10 g，加入含0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80的胰酪大豆胨液體培養基至100 mL，制成均勻的1∶10供試液，按“2.2.1”項下方法依次稀釋至1∶20、1∶50，即得。

2.3 計數方法適用性試驗

2.3.1 常規平皿法 取“2.1”項下菌液0.1 mL，加到“2.2.1”項下1∶10供試液9.9 mL中，混勻，作為試驗組；取稀釋液0.1 mL，加到“2.2.1”項下1∶10供試液9.9 mL中，混勻，作為供試品組；取“2.1”項下菌液0.1 mL，加到稀釋液9.9 mL中，混勻，作為菌液對照組。分別取1 mL注皿(1 mL/皿)，平行制備2個平皿，加入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的TSA或SDA培養基中，混勻，凝固，倒置培養，計算平均菌落數。

2.3.2 稀釋法 取“2.1”項下菌液0.1 mL，加到“2.2.1”項下1∶20、1∶50供試液9.9 mL中，混勻，作為試驗組，其他同“2.3.1”項。取1 mL注皿(1 mL/皿)，平行制備2個平皿，加入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的TSA或SDA培養基中，混勻，凝固，倒置培養，計算平均菌落數。

2.3.3 稀釋法結合添加中和劑法 取“2.1”項下菌液0.1 mL，加到“2.2.2”項下1∶20、1∶50供試液9.9 mL中，混勻，作為試驗組，其他同“2.3.1”項。取1 mL注皿(1 mL/皿)，平行制備2個平皿，加入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的TSA或SDA培養基中，混勻，凝固，倒置培養，計算平均菌落數。

2.4 回收率計算 公式為回收率=[(試驗組平均菌落數-供試品組平均菌落數)/陽性菌組平均菌落數]×100%。

3 結果

3.1 常規平皿法 表1顯示，3批樣品中銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均大于0.5，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均無菌落生長，回收率為0，即本品對后兩者有較強的抑制作用，表明常規平皿法不適用于需氧菌的計數檢查；霉菌酵母菌回收率均符合2020年版《中國藥典》四部要求，故可采用該方法進行上述菌種的計數檢查。

表1 常規平皿法回收率試驗結果(n=3)

3.2 稀釋法與稀釋法結合添加中和劑法 根據表1結果選擇金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，分別按“2.3.2”“2.3.3”項下方法操作，結果見表2～3。由此可知，稀釋倍數不同，2種菌株回收率有明顯差異，并且稀釋倍數越高，回收率越高。

采用稀釋法且當稀釋倍數增加到50倍時，金黃色葡萄球菌回收率有所提高，但仍小于0.5，表明供試液仍有抑菌性；枯草芽孢桿菌回收率較稀釋10、20倍時顯著增高，而且在0.5～2.0范圍內，說明供試液抑菌性已經基本消除。

采用稀釋法結合添加中和劑法時，相同稀釋倍數下的回收率明顯高于采用稀釋法時，當稀釋倍數增加到20、50倍時，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率在0.5～2.0范圍內，達到相關標準，表明供試液抑菌作用已完全消除，但1∶20(1 mL/皿)、1∶50(1 mL/皿)回收率差異不明顯。

表2 金黃色葡萄球菌回收率試驗結果(n=3)

表3 枯草芽孢桿菌回收率試驗結果(n=3)

3.3 計數方法適用性試驗 2020年版四部《中國藥典》[3]規定，若方法適用性試驗回收率符合要求，應以更高稀釋級供試液代替最低稀釋級的供試液進行檢查。因此，本實驗采用0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80作為稀釋劑，對需氧菌計數進行方法學考察[1∶20(1 mL/皿)]，需氧菌、霉菌酵母菌計數分別按“2.3.3”“2.3.1”項下方法操作，結果見表4。

由此可知，3批樣品中各菌株回收率均達到標準，在0.5～2.0范圍內，表明供試液抑菌作用已經消除；敏感菌株回收率升高至0.5以上，并且銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率較“3.1”項下也有大幅提高。

表4 計數方法適用性試驗結果(n=3)

3.4 控制菌檢查

3.4.1 常規法 取1∶10供試液制備試驗組，稀釋液制備陰性組，適宜濃度大腸埃希菌、銅綠假單胞菌制備陽性組。按照2020年版《中國藥典》四部方法檢查大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌，取3批樣品，每批10 g，直接接種到200 mL TSB中，作為樣品組；同法加入適宜濃度沙門菌菌懸液，作為試驗組；取稀釋液適量，作為陰性組，再按照藥典方法檢查沙門菌，結果見表5。

3.4.2 稀釋法 取“2.2”項下1∶20供試液制備試驗組，稀釋液制備陰性組，“2.2”項下1∶20供試液制備樣品組。取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌懸液，作為試驗組；取稀釋液10 mL，作為陰性組。按照2020年版《中國藥典》四部方法檢查大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌，取“2.2”項下1∶20供試液10 mL，直接接種到200 mL TSB中，作為樣品組；同法加入適宜濃度沙門菌菌懸液，作為試驗組；取稀釋液適量，作為陰性組，再按照藥典方法檢查沙門菌，結果見表5。

3.4.3 稀釋法結合添加中和劑法法 取“2.2”項下1∶20供試液10 mL，加到100 mL含0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80液體培養基中制備樣品組；取適宜濃度大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌懸液，制備試驗組；取稀釋液適量，制備陰性組。按照2020年版《中國藥典》四部方法檢查大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌，取“2.2”項下1∶20供試液10 mL，直接接種到含0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80的200 mL TSB中，作為樣品組；同法加入適宜濃度沙門菌菌懸液，作為試驗組；取稀釋液適量，作為陰性組，再按照藥典方法檢查沙門菌，結果見表5。

表5 控制菌檢查結果

3.4.4 結果分析 3種方法下陽性組均能檢出大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌，而陰性組均無菌落生長，即均可用于控制菌檢查。根據2020年版《中國藥典》四部規定結合實驗過程簡便易操作的原則，可選用常規法。

4 討論與結論

微生物限度檢查法的適用性試驗[9]是在無抑菌作用的環境下，將樣品在不同環節受到污染的微生物能被充分地分離檢查出來。由于中藥制劑成分復雜，經常使用的普通檢查法[12]往往不適用，通常需要降低、去除樣品中某些組分的抑菌作用來減少對檢查結果的干擾[17-18]，避免漏檢、誤檢。

本實驗結果表明，靈芝益壽丸具有較強的抑菌活性，故對其進行微生物限度檢查試驗時必須消除上述作用，避免產生結果的偏差。由于稀釋法、中和劑法等不能完全消除靈芝益壽丸抑菌性，而且供試液中大量不溶物嚴重影響了薄膜過濾效率，甚至堵塞濾膜，導致試驗失敗，故本實驗將稀釋法[1∶20(1 mL/皿)]與添加0.3%卵磷脂和5%聚山梨酯-80相結合來進行需氧菌總數計數適用性試驗，再采用常規法進行霉菌酵母菌總數、控制菌檢查，發現各菌株回收率高，而且在藥典要求的范圍內，同時該方法不需要復雜昂貴的設備，操作簡單，操作時間短，結果準確可靠。

綜上所述，本實驗所建立的微生物限度檢查法解決了靈芝益壽丸假陰性問題，對云南地方中藥和民族藥資源的推廣有促進作用，也可應用于其他地區藥材的質量檢驗，從而為中醫藥事業發展作出貢獻。