大孔吸附樹脂分離純化羊肚菌多糖過氧化氫改性物

張雪松， 謝春芹， 凡軍民， 曹 正， 舒 瑾， 苗 雪

(江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院，江蘇 句容 212400)

糖尿病是因胰島素分泌不足或胰島素作用障礙而導致的內分泌類代謝性疾病，糖苷酶抑制劑因其效果持久、毒副作用小、作用溫和等優點廣泛運用于2型糖尿病的治療[1]。近年來，對天然植物來源的糖苷酶抑制劑展開的研究成為熱點[2]。很多中藥包括食藥用菌提取物有降糖作用，多糖成分在其中起著重要作用[3-4]。羊肚菌屬珍稀食藥用菌，羊肚菌多糖具有降血脂、降血糖、抗腫瘤等作用[5-7]。

抑制α-淀粉酶活性的試劑可用于抑制腸道內的淀粉酶活性，阻礙碳水化合物的水解，對高血糖、肥胖癥以及高血脂等具有較好的防治作用[8]。糖苷酶抑制劑中，食用菌多糖來源廣泛，但其生物活性很難與藥物相提并論，限制其應用前景。研究表明，食用菌多糖的糖苷鍵類型、分子量大小等因素均能影響其生物活性，通過改變分子量、空間結構等可以改變食用菌生物活性的有效途徑[9]。課題組前期采用過氧化氫氧化降解羊肚菌多糖組分，提高其對α-淀粉酶的抑制活性[10]。本實驗以α-淀粉酶抑制率為指標，利用大孔樹脂分離純化羊肚菌多糖過氧化氫改性物，通過篩選D101、AB-8、S-8、NKA-9、LX-17大孔樹脂，考察羊肚菌多糖的分離純化影響因素和工藝條件，以期為后續天然來源的糖苷酶抑制劑的工業化應用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 六妹羊肚菌由江蘇農林職業技術學院食用菌教學基地種植，經專家鑒定為正品。20 000 U/mL α-淀粉酶購自上海麥克林生化科技有限公司；氯仿、淀粉、3, 5-二硝基水楊酸(DNS)、過氧化氫為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器 GZLYZ-1型真空冷凍干燥機(諸城市博匯機械有限公司)；Thermo Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo公司)；T6型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；SY-5000型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法

2.1 多糖制備 新鮮羊肚菌滅菌烘干后粉碎過40目篩，參考文獻[10]報道制備多糖，經真空冷凍后為黃色粉末，提取率為10.32%。

2.2 多糖改性物制備 參考文獻[10]報道，稱取多糖1 g，按最佳條件用30%過氧化氫氧化降解羊肚菌多糖，反應液經濃縮、真空冷凍干燥得白色粉末狀改性物0.854 2 g，得率為85.42%。

2.3 α-淀粉酶抑制活性研究 參考文獻[11]報道，取抑制對照管和抑制管，分別加入0.5 mL 2%淀粉溶液和40 mg/L 1.0 mL羊肚菌多糖改性物溶液，取空白對照管和空白管，分別加入蒸餾水1.0 mL，再在抑制對照管加入蒸餾水0.5 mL，抑制劑管和空白管各加入α-淀粉酶(20 U/mL)0.5 mL，37 ℃水浴10 min，再加入DNS試劑1.0 mL，沸水浴加熱5 min后加入蒸餾水10.0 mL。冷卻至室溫后在540 nm波長處測定吸光度(A)，計算抑制率(InR)，公式為InR=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%。

2.4 分離純化研究

2.4.1 預處理 選用AB-8、LX-17、D101、NKA-9、S-8樹脂，分別用95%乙醇浸泡24 h后淋洗，最后用蒸餾水沖洗。

2.4.2 樹脂篩選 取上述5種樹脂各5 g，置于于錐形瓶中，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在30 ℃、100 r/min下吸附24 h，計算吸附率，公式為吸附率=[(初始溶液抑制率-吸附后溶液抑制率)/初始溶液抑制率]×100%。

2.4.3 靜態吸附實驗 參考文獻[12]報道。

2.4.3.1 吸附時間 稱取預處理好的D101樹脂5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在30 ℃ 100 r/min下吸附12 h，每隔1 h測定溶液對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.3.2 吸附溫度 稱取預處理好的D101樹脂5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，分別在20、25、30、35、40 ℃下吸附3 h，測定溶液對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.3.3 樹脂用量 分別稱取預處理好的D101樹脂1、2、3、4、5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在35 ℃下吸附3 h，測定溶液對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4 動態吸附實驗 參考文獻[13]報道。

2.4.4.1 pH值 稱取預處理好的D101樹脂10 g裝柱，用5% NaOH或5%HCl調節多糖改性物溶液至pH值為4、5、6、7、8，倒入100 mL溶液上樣，控制體積流量為2 BV/h，通過2 BV 95%乙醇進行洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測定其對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.2 洗脫劑體積分數 稱取預處理好的D101樹脂10 g裝柱，倒入100 mL pH值為7的多糖改性物溶液上樣，控制體積流量為2 BV/h分別通過2 BV 20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測定其對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.3 洗脫劑用量 稱取預處理好的D101樹脂10 g裝柱，倒入100 mL pH值為7的多糖改性物溶液上樣，控制體積流量為2 BV/h，通過100 mL 80%乙醇洗脫，每1 BV(25 mL)收集1次洗脫液，旋蒸后定容至100 mL，測定其對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.4 上樣質量濃度 稱取預處理好的D101樹脂10 g裝柱，倒入100 mL pH值為7的多糖改性物溶液上樣，質量濃度分別為20、30、40、50、60 mg/L，控制體積流量為2 BV/h，通過80%乙醇2 BV洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測定其對α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.5 上樣體積流量 稱取預處理好的D101樹脂10 g裝柱，倒入100 mL、pH值為7、質量濃度為30 mg/L的多糖改性物溶液上樣，控制體積流量為1、2、3、4、5 BV/h，通過用80%乙醇2 BV洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測定其對α-淀粉酶的抑制率。

2.5 紅外光譜掃描分析 多糖改性物及D101樹脂洗脫產物冷凍干燥樣品磨成粉末后與溴化鉀混合，壓片，在4 000～5 00 cm-1波數范圍內進行紅外光譜掃描分析。

3 結果

3.1 樹脂篩選 由表1可知，多糖改性物溶液被樹脂吸附后，對α-淀粉酶的抑制活性均有所降低，并且差異較大，其中D101吸附后最低，相對吸附率為61.96%，即吸附效果最好。

表1 5種樹脂吸附作用比較

3.2 靜態吸附分析

3.2.1 吸附時間 由圖1可知，前3 h內α-淀粉酶抑制率下降最快，當吸附時間超過3 h后變化不大，說明吸附在3 h后已達到飽和。Ho等[14]發現，大孔吸附樹脂的吸附分為4個過程，在吸附的前3 h，樹脂對多糖改性物中α-淀粉酶抑制成分的吸附主要是在位于表面的活性中心上，主要是通過在溶液以及液膜中的擴散，在樹脂表面即被吸附，而吸附時間超過3 h以后，樹脂表面α-淀粉酶抑制成分吸附量逐漸飽和，多糖改性可通過樹脂的內部孔道擴散到樹脂的內表面上，由于樹脂內部擴散阻力較大，吸附過程趨于平緩直至飽和。

圖1 吸附時間對α-淀粉酶抑制率的影響

3.2.2 吸附溫度 由圖2可知，隨著吸附溫度從20 ℃上升到40 ℃，多糖改性物溶液對α-淀粉酶的抑制率先降低再升高；當吸附溫度為35 ℃時，溶液對α-淀粉酶的抑制活性最低，為5.51%。溫度升高會加快分子運動，有效的降低溶液黏度，減小外擴散和內擴散的阻力，有利于吸附和擴散過程的進行。

圖2 吸附溫度對α-淀粉酶抑制率的影響

3.2.3 樹脂用量 由圖3可知，隨著樹脂用量上升，α-淀粉酶抑制率逐漸下降，為4 g時最低，此時吸附趨于飽和，超過4 g后基本不變。

圖3 樹脂用量對α-淀粉酶抑制率的影響

3.3 動態吸附分析

3.3.1 pH值 由圖4可知，隨著pH值增大，α-淀粉酶抑制率先升高后降低，為7時最高，達24.36%，這可能是由于多糖改性產物分子中存在羥基，在酸性條件下容易質子化，從而削弱和水分子之間的作用力，樹脂吸附力下降，洗脫液對α-淀粉酶的抑制活性下降；但pH過大，大孔樹脂也容易結成塊狀物，不利于對樣品進行吸附[15]。

圖4 pH值對α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.2 洗脫劑體積分數 由圖5可知，隨著乙醇體積分數不斷增加，洗脫液對α-淀粉酶的抑制率呈現出先升高后降低的趨勢，為80%時最高，達27.87%，說明在該體積分數下洗脫得到的目標成分最多。使用非極性D101大孔樹脂時，洗脫劑的極性越小，洗脫能力越強[16]，同時，經過氧化氫氧化降解后羊肚菌多糖改性物分子量相對較小，在不同體積分數乙醇中的溶解度也存在較大差異。

圖5 洗脫劑體積分數對α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.3 洗脫劑用量 由圖6可知，經2 BV乙醇洗脫后，洗脫液對α-淀粉酶的抑制率最高，達36.21%，即洗脫的目標成分最多。洗脫劑用量過少，則洗脫不完全；洗脫劑用量過多，洗脫液中α-淀粉酶抑制物質濃度將會下降，會降低其抑制效果。

圖6 洗脫劑用量對α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.4 上樣質量濃度 由圖7可知，隨著上樣質量濃度的增大，洗脫液對α-淀粉酶的抑制率呈現出先升高后降低的趨勢，其原因可能是上樣質量濃度較低時，多糖改性物溶液中的α-淀粉酶抑制物質與樹脂內表面接觸機會減少，擴散到樹脂表面以及孔道內的速度較慢，影響吸附的效果；隨著上樣質量濃度的增加，多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物質與樹脂內表面接觸機會逐漸增加，更多前者被樹脂吸附并洗脫，洗脫液抑制活性提高，但若上樣質量濃度過高，多糖改性物溶液中其他物質可能會與α-淀粉酶抑制物質形成吸附競爭關系，甚至形成沉淀而造成孔道堵塞，降低擴散速率，影響吸附效果，同時當樹脂吸附達到飽和以后，單純地增加上樣質量濃度對提高洗脫液的α-淀粉酶抑制率影響不大。本實驗發現，上樣質量濃度為30 mg/L時，對α-淀粉酶的抑制率達到最高，為40.33%。

圖7 上樣質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.5 上樣體積流量 由圖8可知，隨著上樣體積流量的上升，洗脫液對α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，為1～3 BV/h時較高，為2 BV/h時最高，為40.33%。上樣體積流量過大，多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物質在樹脂層停留的時間就會短，與樹脂的接觸時間減少，吸附效果降低，洗脫液對α-淀粉酶的抑制率就會隨著體積流量的增加而減小；上樣體積流量過小，則會延長試驗和生產時間，不利于經濟生產。

圖8 上樣體積流量對α-淀粉酶抑制率的影響

3.4 分離純化前后樣品表征 由圖9可知，羊肚菌多糖改性物及其D101樹脂洗脫物均在1 150 cm-1左右處出現環上C-O吸收峰，1 630 cm-1左右處出現-OH彎曲振動吸收峰、2 920 cm-1左右處出現C-H伸縮振動吸收峰，3 420 cm-1左右處出現-OH伸縮振動吸收峰等多糖的典型吸收特征，說明采用D101大孔樹脂分離純化多糖過氧化氫降解改性產物所得洗脫物仍然具有典型的多糖結構。

圖9 分離純化前后傅里葉紅外光譜圖

4 討論

本實驗通過篩選D101、AB-8、S-8、NKA-9、LX-17大孔吸附樹脂對羊肚菌多糖改性物中α-淀粉酶抑制組分的吸附效果，確定D101大孔樹脂為目標樹脂。結果，最佳純化條件為上樣質量濃度30 mg/L，pH值7，吸附溫度35 ℃，樹脂用量4 g，上樣體積流量2 BV/h，2 BV 80%乙醇洗脫，洗脫產物對α-淀粉酶抑制率為40.33%，相較純化前提高了2.45倍。紅外圖譜表明，純化后的洗脫物仍具有多糖的吸收特征。本實驗用5倍上樣量及樹脂用量進行放大驗證，重復3次測得洗脫產物的平均收率為50.17%，對α-淀粉酶的抑制率為40.95%，基本與放大前相當。

目前，分離純化常用的方法有超臨界CO2法、色譜法等，但工藝相對較為復雜，成本較高[17]。大孔樹脂比表面積較大，并且具有優良網狀結構，在萜類、黃酮類以及苷類等各種天然產物活性成分分離純化領域應用廣泛[18]。本實驗針對羊肚菌多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物質所建立的大孔樹脂分離純化工藝合理、簡單可行，并且分離純化效果較好，為進一步研究羊肚菌多糖及其改性物組分降糖能力提供依據。結果，分離純化羊肚菌多糖過氧化氫改性產物所得洗脫物仍然具有典型的多糖結構，利用D101大孔樹脂進行了初步的分離提純。下一步，將結合凝膠層析技術，獲取具有較高α-淀粉酶抑制活性且組分較為單一的多糖成分，為后續羊肚菌多糖及其改性產物的組成、結構以及活性分析提供基礎。