橙皮苷脂質體的制備及其體內藥動學研究

禹 瑞， 呂東霞， 談秀鳳, 2

(1.鄭州澍青醫學高等專科學校，河南 鄭州 450064；2.上海中醫藥大學，上海 201203)

橙皮苷是廣泛存在于蝶形花科、蕓香科、豆科植物中的二氫黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、調節糖脂質代謝、抗炎、保護心血管系統等藥理活性[1-3]，在婦科腫瘤及護理中也有較多應用[3]，但該成分水溶性和脂溶性均較差[4]，胃腸道容易被代謝[5]，生物利用度僅為3.51%[6]，從而限制其活性發揮及臨床應用。目前，關于橙皮苷制劑新技術的研究涉及磷脂復合物[7]及其固體分散體[4]、自微乳[8]、包合物[9]等。

脂質體是一種具有類生物膜的納米囊泡，主要材料是磷脂、膽固醇等，均可在機體內降解[10-11]，故生物相容性好，安全性高。文獻[12]報道，脂質體可有效改善藥物溶解度及跨膜滲透性，將藥物包裹后可使其免受體內各種酶的破壞作用，最終提高體內穩定性、生物利用度、藥效等[13-14]。本實驗制備橙皮苷脂質體，并對其體內藥動學進行研究，以期為今后相關工作奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(配置DAD檢測器、溫控進樣器，美國Agilent公司)；SH-2-001型磁力攪拌器(常州市億能實驗儀器廠)；FA2204N型電子分析天平(配置防風罩，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；RE-52AA型旋轉蒸發儀(紹興上虞艾科儀器設備有限公司)；Tevnai-G2型透射電鏡(美國Fei公司)；FD-1C-50掛瓶型冷凍干燥機(江蘇恒敏儀器制造有限公司)；JC-WD-24型氮氣吹掃儀(青島聚創環保集團有限公司)等。

1.2 試劑與藥物 橙皮苷對照品(批號110721-201927，純度98.8%，中國食品藥品檢定研究院)；橙皮苷原料藥(批號MUST-18916011，純度97.0%，成都曼思特生物科技有限公司)；大豆磷脂酰膽堿(批號201016-2，上海輔必成醫藥科技有限公司)；膽固醇(批號20200719，上海譜振生物有限公司)。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，體質量230～260 g，購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK(豫)2016-0001，在溫度25 ℃、相對濕度45%的條件下飼養。

2 方法與結果

2.1 橙皮苷含量測定

2.1.2 線性關系考察 取橙皮苷對照品20.08 mg至50 mL量瓶中，加入3 mL吡啶溶解，甲醇定容至刻度，得401.6 μg/mL貯備液，流動相依次稀釋至20.08、10.04、5.02、1.004、0.502、0.02 μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=16.478 2X+0.976 3(r=0.999 8)，在0.02～20.08 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取脂質體混懸液1 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲處理3 min后定容，過0.45 μm微孔濾膜，取5 mL續濾液，置于10 mL量瓶中，流動相定容，即得。

2.1.4 方法學考察 按“2.1.3”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷峰面積RSD為1.58%，表明該方法重復性良好。取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷峰面積RSD為0.64%，表明溶液在48 h內穩定性良好。取0.02、5.02、20.08 μg/mL對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得橙皮苷峰面積RSD分別為0.96%、0.22%、0.47%，表明儀器精密度良好。取9份橙皮苷脂質體，每份0.5 mL，加入對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL各3份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷平均加樣回收率分別為100.32%、99.15%、100.77%，RSD分別為1.02%、1.60%、0.81%。

2.2 脂質體制備 采用薄膜分散法[13-14]，取50 mg橙皮苷、1 g大豆磷脂酰膽堿，置于圓底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇，在50 ℃下磁力攪拌至澄清，加入處方量膽固醇，繼續攪拌至澄清后置于旋蒸儀(水浴溫度50 ℃)中抽真空，除去有機溶劑，加入一定pH值的水相溶液30 mL，在一定溫度下振蕩使其充分水化，超聲處理15 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 包封率、載藥量測定 采用低溫高速離心法[15]，取2 mL橙皮苷脂質體，4 ℃、14 500 r/min離心45 min，取上清液，HPLC法測定游離藥量W1；取離心后沉淀物，真空干燥后精密稱定質量W；按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定總藥量W0，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(W0-W1)/W0]×100%、載藥量=[(W0-W1)/W]×100%。

2.4 粒徑、Zeta電位測定 取0.2 mL脂質體，加入5 mL蒸餾水稀釋，取約3.5 mL至比色皿中，采用粒徑分析儀測定粒徑、Zeta電位。

2.5 單因素試驗 以包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位為評價指標，對其進行歸一化處理后得到總評“歸一”值(OD值)。參考文獻[16]報道，包封率(d1)、載藥量(d2)、Zeta電位絕對值(d3)越大越好，公式為d1～3=(Mi-Mmin)/(Mmax-Mmin)；粒徑(d4)越小越好，公式為d4=(Mmax-Mi)/(Mmax-Mmin)，Mi為測量值，Mmax和Mmin為所有試驗中最大值和最小值，OD值=d1×25%+d2×25%+d3×25%+d4×25%。

2.5.1 藥脂比 固定橙皮苷用量50 mg，大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例12.5∶1，水相pH值6.8，水化溫度40 ℃，分別考察藥脂比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結果見表1。由此可知，隨著脂質用量增加，包封率逐漸升高，載藥量、粒徑逐漸降低，而Zeta電位絕對值先升后降，在1∶20時OD值最高，故以其為最佳藥脂比。

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表1 藥脂比對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.5.2 大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例 固定橙皮苷用量50 mg，藥脂比1∶20，水相pH值6.8，水化溫度40 ℃，分別考察大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例8∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結果見表2。由此可知，隨著大豆磷脂酰膽堿用量增加，包封率、載藥量、Zeta電位絕對值均呈現先升高后降低的趨勢，而粒徑恰好相反，在12.5∶1時OD值最高，故以其為最佳大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例。

表2 大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.5.3 水相pH值 固定橙皮苷用量50 mg，藥脂比1∶20，大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例12.5∶1，水化溫度40 ℃，考察水相pH值5.5、6.0、6.5、7.0對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結果見表3。由此可知，隨著水相pH值增加，包封率、載藥量均呈現先升高后降低的趨勢，而粒徑恰好相反，在6.5時OD值最高，故以其為最佳水相pH值。

表3 水相pH值對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.5.4 水化溫度 固定橙皮苷用量50 mg，藥脂比1∶20，大豆磷脂酰膽堿與膽固醇比例12.5∶1，水相pH值6.5，分別考察水化溫度30、35、40、45、55 ℃對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響，結果見表4。由此可知，隨著水化溫度增加，包封率、載藥量均呈現先升高后降低的趨勢，可能是由于溫度過低(低于大豆磷脂酰膽堿相變溫度)不利于脂質膜吸水溶脹，從而影響包裹藥物效率[13,17]，但溫度過高又可能會影響大豆磷脂酰膽堿穩定性，導致包封率、載藥量降低，在45 ℃時OD值最高，故以其為最佳水化溫度。

表4 水化溫度對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位的影響(n=3)

2.6 驗證試驗及凍干粉制備 平行制備3批脂質體，按“2.5”項下結果進行驗證試驗，測得包封率為(75.41±1.78)%，載藥量為(3.61±0.28)%，粒徑為(161.28±8.04)nm，PDI為0.092±0.018，Zeta電位為(-24.86±1.77)mV，見圖1～2。

圖1 橙皮苷脂質體粒徑分布

圖2 橙皮苷脂質體Zeta電位

采用10%葡萄糖-甘露醇(1∶1)作為凍干保護劑，加到脂質體混懸液中，混勻后取3 mL至西林瓶中，置于-30 ℃冰箱中冷凍2 d后放到-25 ℃真空凍干機中冷凍2 d，即得凍干粉，其包封率為(70.31±1.46)%，粒徑為(187.76±8.79)nm，PDI為0.162±0.031，Zeta電位為(-22.23±1.52)mV，外觀見圖3，可知其外形飽滿，色澤均一。

圖3 脂質體混懸液(A)、凍干粉(B)外觀

2.7 體外釋藥研究

2.7.1 人工胃液制備 取3.8 mL濃鹽酸，加入500 mL純化水；另取10 g胃蛋白酶，加入400 mL純化水溶解，將2種溶液合并后加入5 mL 吐溫-80，純化水定容至1 000 mL，搖勻后超聲處理15 min，即得。

2.7.2 人工腸液制備 取6.8 g磷酸二氫鉀，加入500 mL純化水溶解，0.1 mol/L NaOH調節pH至6.8；另取10 g胰蛋白酶，加入400 mL純化水溶解，將2種溶液合并后加入5 mL吐溫-80，純化水定容至1 000 mL，搖勻后超聲處理15 min，即得。

2.7.3 操作過程 橙皮苷在25 ℃水、人工胃液、人工腸液中的溶解度分別為28.63、116.79、202.04 μg/mL，故30 mg該成分在1 000 mL人工胃液或人工腸液中可達漏槽條件。取橙皮苷及其脂質體凍干粉(含20 mg橙皮苷)適量，加入3 mL人工胃液，置于透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)中，兩端系緊。取1 000 mL人工胃液作為釋放介質，設置轉速為100 r/min，溫度為37 ℃，在0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h各取樣4 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算累積釋放度，然后將兩者在人工腸液中進行相同實驗，結果見圖4。由此可知，脂質體在人工胃液、人工腸液中36 h內累積釋放度分別為84.26%、79.61%，均明顯高于原料藥。

圖4 橙皮苷體外釋藥曲線(n=3)

2.8 體內藥動學研究

2.8.1 分組、給藥與采血 取橙皮苷、物理混合物(空白脂質體凍干粉+橙皮苷)、脂質體凍干粉適量，0.3%CMC-Na溶液制成灌胃液(橙皮苷質量濃度均為10 mg/mL)，臨用現配。18只大鼠禁食12 h，自由飲水，隨機分為取橙皮苷組、物理混合物組、橙皮苷脂質體組，每組6只，稱定質量，5 mL注射器吸取灌胃液后通過灌胃針輸送至胃內，劑量均為60 mg/kg。乙醚麻醉大鼠后，于0、0.167、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶后靜脈叢取血各約0.3 mL，置于抗凝劑浸潤后的離心管中，3 000 r/min離心2 min，取上層淺黃色血漿，冷凍保存。

2.8.2 血漿處理 參考文獻[6]報道，取100 μL血漿至離心管中，加入甲醇1.0 mL，密封后渦旋5 min，0 ℃、6 000 r/min離心6 min，取有機相至另一空白離心管中，40 ℃氮氣吹除有機溶劑，得殘渣，100 μL甲醇復溶。

2.8.3 線性關系考察 取橙皮苷對照品適量，甲醇制成4 016、2 008、1 004、502、100.4、20.08 ng/mL溶液，分別取100 μL，40 ℃氮氣吹除有機溶劑，得殘渣，加入100 μL空白血漿密封渦旋5 min，按“2.8.2”項下方法處理，即得血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=0.004 7X+0.224 8(r=0.990 7)，在20.08～4 016 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.8.4 專屬性試驗 取空白血漿、給藥12 h后血漿、20.08 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖5，可知該方法專屬性良好。

1. 橙皮苷1.hesperidin

2.8.5 方法學考察 分別取20.08、1 004、4 016 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測定橙皮苷峰面積RSD分別為10.91%、6.78%、8.44%，表明儀器精密度良好。取上述3種溶液適量，于0、3、6、9、12、18、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷峰面積RSD分別為8.04%、4.96%、7.13%，表明溶液在24 h內穩定性良好。取上述3種溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定3次，測得橙皮苷平均加樣回收率分別為93.66%、88.75%、91.80%，RSD分別為9.93%、4.76%、8.17%。

2.8.6 結果分析 血藥濃度采用DAS2.0軟件進行非房室模型擬合，統計矩法計算主要藥動學參數，達峰濃度(Cmax)、藥-時曲線下面積(AUC)經對數轉換后進行t檢驗，達峰時間(tmax)、半衰期(t1/2)采用非參數法秩和檢驗，結果見表5、圖6。由此可知，與原料藥比較，物理混合物tmax、t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞有一定變化，但差異無統計學意義(P>0.05)，表明簡單混合后并不能起到明顯的促吸收作用；與原料藥、物理混合物比較，脂質體tmax延長(P<0.01)，t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，口服生物利用度提高至4.16倍。

3 討論

本實驗發現，橙皮苷原料藥在達到漏槽條件時仍未完全溶出，可能與其粒度較大、疏水性較強等原因有關[18]。前期報道，脂質體在人工胃液中的穩定性相對較低，但在人工腸液中較高，并且結構穩定，可發揮緩釋作用[10,14]，與本實驗結果一致。另外，糖類凍干劑可通過水取代機制附著在脂質體周圍[19]，進而起到保護作用，但其外觀一般較差，故需與醇類保護劑聯合使用以彌補不足。

表5 橙皮苷主要藥動學參數

圖6 橙皮苷血藥濃度-時間曲線(n=6)

凡小燕[8]將橙皮苷制成自微乳，但需使用大量表面活性劑。牛曉磊等[4]對橙皮苷磷脂復合物固體分散體進行研究，但藥物與磷脂復合物容易發生解離，生物利用度的提高程度有限(僅為2.54倍)。本研究制備了橙皮苷脂質體，輔料安全性高，tmax延長，可能是由于脂質體緩釋作用所致，同時也影響了入血速度，使t1/2延長；Cmax升高可能與脂質體促進原料藥釋放有關。李正榮[20]報道，脂質體口服3 h后在大鼠胃腸道中均可檢測到，表明該劑型在機體內可保持原有結構，有助于發揮其促吸收作用；本實驗發現，橙皮苷脂質體生物利用度得到提高是多種原因共同作用的結果，如脂質體促進藥物釋放、降低首過效應、增加藥物滲透性、延長藥物t1/2使其被充分吸收等[14,21]。

本實驗結果顯示，雖然物理混合物生物利用度有所提高，但程度遠低于橙皮苷脂質體，表明未被破壞的脂質體發揮了促吸收作用。脂質體口服后，在體內的結構穩定性、表面性質、膳食成分等因素也會影響其遞藥效率及生物利用度的提高程度。