適用于乳房組織工程的支架材料及制備工藝

祝旭龍 劉鑫淼 吳姝涵 李建輝

【提要】 乳房組織工程被認為是乳房重建的終極方案。乳房是特殊的軟組織，支架材料作為組織工程的三大要素之一，在乳房組織工程當中顯得尤為重要。理想的支架材料應具備與目標組織相似的物理和生化特性，適宜的生物化學和物理環境，能夠調節種子細胞對特定組織工程要求的響應。生物材料的特性（例如機械和化學功能性）影響細胞黏附、增殖和分化等行為，所以理想的支架應具有良好的生物相容性，從而防止長期免疫反應的發生。此外，良好的生物支架應具備適宜的多孔結構，以利于血管生成并為細胞的增殖分化提供營養物質。以上與支架的材料選擇及制備工藝都有直接的關系，本文列舉了可用于乳房組織工程研究的支架材料，并根據乳房組織特性選擇相關制備工藝進行介紹。

乳腺癌是全球女性發病率最高的癌癥之一，且呈逐年升高的趨勢[1]。乳腺癌導致的乳房缺失或畸形，極大地影響了患者的身心健康和生活質量。此外，乳腺葉狀腫瘤、肉芽腫性乳腺炎等良性乳腺病，也會造成患側乳房的較大缺損或畸形。以重建為目的的乳房組織工程，基于以上醫源性因素及較高的發生率，獲得了較高的關注度。由于人體對生物材料的各種反應相當復雜，所以對材料的設計、選擇、改性、復合和制造等環節均是十分關鍵的，最終應形成乳房組織相似甚至相同的三維結構、理化性質和功能。天然高分子材料普遍生物特性好但機械性能低；人工合成高分子材料支架最主要的優勢在于精確的可操控性，包括可以人為控制分子量、形狀、孔隙率、微細結構、機械彈力強度等。然而，人工合成支架的降解產物可能導致局部環境的pH 值變化進而產生炎癥。同時，人工合成材料的質地相對堅硬，與正常乳房組織存在差異，導致乳房重建術后愈合延遲和許多并發癥的發生[2]。來源于脂肪組織的脫細胞支架（Decellularization of adipose tissues，DAT）具有天然的優勢，具備低免疫原性、良好的生物學性能及機械性能，可模擬天然細胞外基質結構，為種子細胞的黏附、生長、增殖提供了三維環境，具有促脂肪生長和促血管新生作用。目前的支架材料普遍難以生產較大體積的脂肪組織，難以同時實現脂肪組織結構的正確模擬和血管通道網的系統集成[3]。

1 天然高分子材料

1.1 透明質酸

1934 年，首次從牛眼玻璃體液中分離出一種新的糖胺聚糖[4]，即透明質酸（Hyaluronic acid，HA），具有優異的生物特性。目前，HA 基支架以水凝膠、網片和海綿等形式被廣泛應用于組織工程研究中[5-7]。有研究通過直接注射，將主要含有非動物源性的穩定性透明質酸（Non-animal stabilized hyaluronic acid，NASHA）醫用材料Macrolane 植入患者乳房進行安全性研究。結果表明，植入后雖能取得良好的美容效果，但受區發生紅腫、疼痛等不良反應[8]。此外，直接注射HA進行乳房重建時，部分患者會產生乳房腫塊和皮下結節，不僅會降低美容效果，而且將干擾對影像結果的判斷而妨礙乳腺腫瘤的早診早治[9]。因此，單純可直接注射的HA 材料應用于乳房重建的安全性及適用范圍亟待考究。目前最為常見的是利用HA 與理想的天然或人工材料復合改性，以達到取長補短的目的。Chang 等[10]制備的HA-明膠冷凍凝膠復合支架，具有高延展性、柔韌性佳的力學性質，也具有高孔隙率、孔徑大、高溶脹比及親水性等理化性質。體內和體外試驗均表明該支架促進脂肪干細胞等成脂肪細胞黏附、增殖、分化，有利于脂肪組織的新生并促進血管化。雖然HA 來源的材料應用于乳房重建并沒有較為成熟的研究及策略，但其具有高度生物相容性、黏附性、保水性及力學穩定性，同時其來源豐富、價格低廉、易于加工，這些特性有利于工程化脂肪的構建，有待于進一步的研究及改良。

1.2 殼聚糖

殼聚糖是通過甲殼素的脫乙酰化獲得的，甲殼素是甲殼類動物、軟體動物和昆蟲的外骨骼以及真菌的細胞壁上發現的一種聚合物，醫用殼聚糖（Medical chitosan，MC）作為一種抗粘連劑，被用來降低乳房重建術后包膜攣縮的發生率[11]。Li 等[12]的動物研究發現，MC 可通過抑制組織金屬蛋白酶（TIMPs）的表達和破壞ECM 的形成來減少包膜的厚度，證明了MC 有可能降低乳房重建手術后早期發生包膜攣縮的風險。研究表明，殼聚糖/膠原、殼聚糖/PLGA 等復合多孔支架，具有良好的生物相容性，其在體內、體外試驗中對脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖分化有促進作用，并能在小鼠體內形成新的脂肪組織，有望成為脂肪組織工程的生物支架材料[13-14]。由于殼聚糖具有良好的組織相容性、降解速率可調節、易于加工制作，且具有抗菌、抗氧化等生物特性，也常用作皮膚、軟組織、骨組織再生的支架材料或輔料[15-16]。

1.3 膠原

膠原蛋白是細胞外基質的一種結構蛋白。除軟骨組織外，所有組織都含有人體內最豐富的Ⅰ型膠原纖維，皮膚、軟組織中還含有較多的Ⅲ型及Ⅵ型膠原[17]。膠原是天然ECM 中含量最豐富的蛋白質，作為組織工程學支架材料具有非常高的仿生潛力[18]。同樣的，在乳房組織工程方面，Ⅰ型膠原支架能夠支持長達24 周的脂肪生成[19]。Davidenko 等[20]采用冷凍干燥技術制備了3D 多孔膠原-透明質酸支架，這些支架能夠支持3T3-L1 前脂肪細胞的增殖和分化，增強了功能基因表達，不僅能生成脂肪組織，還增強了乳腺脂肪組織的體外發育能力。為了適應臨床需求，尤其是乳腺癌術后乳房重建等較為復雜的內部環境，Baldwin 等[21]研制出一種單寧酸/膠原珠狀注射材料，利用單寧酸具有抗癌和抗菌的特性，聯合膠原復合成支架。結果表明，不僅脂肪組織及新生血管能隨著植入材料的降解而逐漸形成，實驗動物也未出現植入排斥、細菌感染、死亡等現象。與其他材料支架相比，膠原蛋白支架的優點是抗原性低、生物相容性好、生物可降解。然而，由于純膠原支架的機械強度較低、降解速率較快，很難將其單獨用作支架材料，所以膠原通常與其他天然或人工合成材料復合制作組織工程支架。

1.4 其他天然材料

絲素蛋白是蠶絲的主要組成部分，具有兩性荷電的特殊性能和良好的生物相容性及生物降解性，易于塑形，是一種理想的醫用材料。Hanken 等[22]的研究顯示，絲素蛋白支架對人體脂肪前體細胞具有優異的細胞相容性且可促進脂肪分化；在絲素蛋白纖維上表達的生長因子VEGF 和FGF-2 可能對前脂肪細胞產生潛在的積極影響，在脂肪組織工程和再生醫學中擁有應用潛力。

明膠是膠原部分水解而得到的一類大分子蛋白質，因其良好的生物相容性、低免疫原性，已被廣泛加工成支架材料，且其與脂肪軟組織相似的固體機械性能是脂肪組織重建所必需的。Sutrisno 等[23]設計研究了一種黑磷納米片（BPNSs）和明膠的雙功能復合支架，以殺死乳腺癌細胞并誘導脂肪組織重建。實驗結果顯示，BP-明膠復合支架和明膠對照支架均能夠使脂肪細胞黏附、存活及增殖，而復合支架具有良好的生物相容性，降解產物無毒，且能夠促進hMSCs 的成脂分化，有望成為殺傷乳腺癌細胞和促進脂肪組織重建的新平臺。

海藻酸鹽是一種可自然生物降解的聚合物，可以將種子細胞封裝其內以形成可注射的水凝膠或預成型的支架。Yang等[24]利用層粘連蛋白修飾海藻酸鹽，將ADSC、人參皂苷Rg1與材料混合，通過生物電噴霧制備成為可注射納米微球凝膠（ADSC-G-LAMS）。將復合材料注射至乳房缺損模型，通過模擬脂肪形成的胚胎環境，促進了大鼠脂肪組織再生，同時Rg1 的釋放誘導了血管的形成，提高了ADSC 及脂肪細胞的存活率。ADSC-G-LAMS 微球可以較好地負載干細胞和血管生成因子，有望用于腫瘤切除術后的乳房重建。

2 人工合成高分子材料

2.1 聚乳酸-羥基乳酸共聚物

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）由兩種單體——乳酸和羥基乙酸按比例聚合而成，具有完全可生物降解性，其體內降解的最終代謝產物為水和CO2，不在體內蓄積，幾乎沒有毒副作用，是FDA 批準用于臨床的少數合成聚合物之一。PLGA 及其組成部分PLA 應用均較廣泛[25]。當ADSCs 在含有成脂因子的PLA 支架上培養時，脂肪生成轉錄水平顯著上調，且有大量脂質積聚[26]。Chhaya等[27]利用PLA 乳房支架進行了裸鼠模擬試驗，結果顯示PLA支架憑借良好的機械性能承受了組織收縮力而不損失任何質量，24 周后移植區域生成了大量來源于宿主的脂肪細胞，移植區域炎癥反應較輕，脂肪組織間纖維化組織相對較少。Kim 等[28]制備了PLGA/氫氧化鎂復合支架，移植后顯示出較好的抗炎及促血管生成作用，在此基礎上自體脂肪組織移植，明顯降低了移植脂肪的吸收率。另有研究表明，以PLGA支架為基礎的工程脂肪組織可成功再生硬膜外脂肪，減少椎板切除術后硬膜外瘢痕的形成[29]。PLA、PLGA 具有絕佳的生物相容性，應用范圍廣泛，但也存在降解速度慢、疏水性和柔韌性差等缺點[30-31]。

2.2 聚己內酯

聚己內酯（Polycaprolactone，PCL）相較于PLGA 具有更好的柔韌性，降解更加緩慢，被廣泛用于醫用生物降解材料及藥物控制釋放體系。Lee 等[32]將脂肪基質細胞分別接種至天然纖維蛋白支架與PCL 支架表面，發現PCL 支架上的脂肪組織再生良好，脂肪生成基因的表達顯著增加。然而，未經修飾的PCL 通常是疏水性的，不利于種子細胞黏附，且其緩慢和不穩定的降解阻礙了組織的替換。因此，為了滿足不同組織構建的需要，PCL 需與其他材料復合來控制支架的性能，從而使支架的降解與新發生的組織發育相一致，滿足乳房重建時脂肪生成與血管生長兩大關鍵因素。Sawadkar 等[33]利用不同比例的天然材料與PCL 復合制造支架以研究其生物活性，通過研究成脂關鍵基因PPARγ 的表達，指出PCL 基復合材料有利于脂肪生成，且篩選出PCL-膠原-纖維蛋白復合材料是促血管生成能力最強的材料?？傊琍CL 材料與其他材料復合，可使其兼具合適的機械強度和良好的生物相容性，有利于乳房組織的工程化構建。

2.3 其他合成材料

聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）水凝膠由于良好的生物相容性、可溶性及降解產物無毒等，被廣泛應用于組織工程領域。Brandl 等[34]證明了PEG 水凝膠在移植后可促進前脂肪細胞增殖和分化，具有作為脂肪組織工程支架材料的潛能。

聚氨酯（Polyurethane，PU）材料以其原料來源豐富、分子結構多樣化、可修飾的性質，被制備為性能各異的多用途組織工程支架。Wittmann 等[35]將可生物降解的聚己內酯基PU支架與穩定的纖維蛋白凝膠相結合，用于生成體積穩定的脂肪組織結構。研究發現，該材料在體內、外均可以促進脂肪組織發育，并具有良好的促血管生成作用。Wiggenhauser 等[36]也證實了PU 在脂肪組織工程領域的潛力，發現PU 泡沫支架上纖維組織生成和脂肪再生較PCL 支架更加明顯。

醫用聚丙烯（Polypropylene，PP）因結構多樣化及良好的理化，被廣泛用于外科領域。Cheng 等[37]制備了一種ADSCs 復合聚丙烯網狀支架，將其植入雌兔腹壁并進行評估，結果表明復合支架誘導產生的慢性炎癥反應較單一支架更輕，表明了復合支架優異的細胞相容性，并可降低早期炎癥反應及纖維化程度。由于傳統的單一PP 支架較易引起免疫排斥及局部炎癥，目前已有研究傾向于用其他物質（如聚多巴胺等）來改善支架本身的生物相容性[38]。

3 脫細胞脂肪組織基質

3.1 DAT 的誘導成脂作用

經過脫細胞處理后，脂肪脫細胞組織基質（DAT）常被用作生物支架，如可注射凝膠、干燥粉末、多孔泡沫、生物墨水等[39]。DAT 在皮下植入后形成脂肪組織的能力已在不同的動物模型中得到證實，現有研究表明天然DAT 及其衍生物均具有誘導脂肪生成的作用[40]。作為脂肪組織工程中最重要的種子細胞——人脂肪源性干細胞（HASC），能夠在DAT 支架中良好地生長分化并促進脂肪的生成。DAT 本身具有招募宿主基質/干細胞促進脂肪生成的潛能，含HASC 的DAT 植入小鼠體內后更加能夠誘導脂肪組織的形成[41-43]。由于DAT 天然的機械強度較差，聯合其他材料可以改變DAT 的機械強度、彈性等力學性能，從而能夠加強DAT 的成脂誘導能力[44-45]。另外，通過表面改性也能促進DAT 的應用。Cheung 等[46]用甲基丙烯酸酷硫酸軟骨素（Methacrylated chondroitin sulphate，MCS）交聯DAT，發現交聯后的DAT 誘導成脂能力得到加強。Lu 等[47]用碳化二亞胺（1-ethyl-3-carbodiimide，EDC）和經基唬拍酞亞胺（N-hydroxysuccinimide）交聯堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），發現交聯bFGF 的小鼠DAT 血管化更好，表達更高的成脂相關蛋白。Adam 等[48]發現，交聯谷氨酰胺轉氨酶的DAT 其成脂能力與種植ASCs 的DAT 類似，均優于單純DAT 支架植入。對于乳房組織工程而言，DAT 支架由于來源于脂肪而具有先天的優勢，其良好的生物相容性及適宜的分子構成均是其他材料無法比擬的[49]。

3.2 DAT 的來源選擇

Haddad 等[50]對比研究了不同脂肪組織庫來源的DAT，并用MRI 評估效果，發現來源于乳房和腹部的DAT 的填充效果均優于單純乳房脂肪組織填充。由于從人體直接獲取相應的組織來進行相關的醫學實驗存在倫理問題，所以從動物體內獲取脂肪組織是目前較為常用的手段，因為豬等哺乳動物與人類有著相似的解剖學和生理特性[51]。此外，不同部位的脂肪也存在一定的差異。Lin 等[52]通過實驗比較了來自豬皮下組織（SDAT）和內臟脂肪組織（VDAT）的DAT 的成脂能力，結果顯示VDAT 支架在體內的脂肪生成效果優于SDAT 支架。培養人脂肪源性干細胞（ADSCs）的體內試驗結果顯示，VDAT組的脂肪再生率高于SDAT 組，說明豬內臟脂肪組織是制備DAT 的優秀候選組織。但目前脫細胞技術尚在研究發展階段，經各種技術處理產生的DAT 的質量及產量較低，且目前尚無任何一種方法能夠在完全去除免疫源性物質的同時保留完整的細胞外基質結構，這仍需進一步探索研究。

表1 天然材料的優缺點

表2 人工合成材料的優缺點

4 乳房組織工程支架的制備工藝

4.1 3D 打印

3D 打印技術是一種通過計算機輔助，并以多次逐層沉積的方式將生物材料、生長及分化因子和種子細胞等功能組件，按照需求精確定位并加工制造的一種增材制備工藝[53]。在乳房重建術前評估方面，有研究使用MRI 并通過3D 打印對乳房植入物進行更精確的體積分析，從而用于術前觸覺反饋及手術指導[54]。MRI 與3D 打印技術結合也被應用于術前建模，以更好地預估乳腺癌保乳手術的切除范圍。3D 打印可以制備體積形狀適宜、孔徑均勻的支架材料。Tytgat 等[55]將甲基丙烯酰胺明膠（Gel-MA）和甲基丙烯化κ-角叉菜膠（Car-MA）合成為混合凝膠，通過3D 打印技術將其制備成為乳房支架，研究顯示其力學性能接近于天然乳腺組織。Luo等[56]使用3D 打印技術制作了海藻酸鹽-聚多巴胺（Alg-PDA）支架并植入乳腺癌小鼠體內。實驗表明，Alg-PDA 支架的彈性模量和柔韌性與正常乳腺組織相似；具有良好的光熱效應，可有效殺死癌細胞；支持乳腺上皮細胞的增殖。如果這種支架可用于乳房重建，將降低局部乳腺癌復發的風險，提升整形美容效果。張聚良等[57]首次利用3D 打印技術實施保乳手術。通過MRI 模擬乳腺腫瘤切除術后缺損數據并構建三維圖像，利用3D 打印技術制備PCL 支架，將支架直接填充乳房創腔，術后未出現感染、血腫等并發癥。填充物在2 年時間內逐漸降解，并有肉芽組織逐漸向填充物內部生長，填充物周圍血供豐富，組織相容性及美容效果良好[58]。

但是，3D 打印制備的乳房支架嚴重受制于打印機精度和“墨水材料”，目前適用于3D 打印的材料并不廣泛，其理化性質的設置，對所種植的種子細胞影響巨大，也將間接影響脂肪組織再生和血供的形成[59]。臨床中，不同年齡、不同個體層次的乳腺組織力學模量不同，3D 打印的精度直接影響支架材料的柔性，也是未來亟待解決的難題。

4.2 靜電紡絲

靜電紡絲技術主要依靠納米纖維堆積，是制造柔性材料的常用技術[60]。其技術原理是在電紡噴嘴尖端和接地收集器之間施加電場，液滴在噴嘴的末端形成微球。隨著電場強度的增加，尖端的微球伸長，形成稱為泰勒錐的錐形形狀，并從尖端延伸得到纖維絲[61]。Unnithan 等[62]開發了一種基于靜電斥力電紡原理并復合了CMMA（羧貝甜菜堿-甲基丙烯酸甲酯）共聚物的新型3D 靜電紡絲支架（CMMA 3NF），發現該支架可以促進前脂肪細胞的附著、增殖及分化，證實了其在乳房組織工程和美容整形外科領域的適用性。靜電紡絲支架擁有較好的力學性能，但支架孔隙率不易調節、產品產量較低，且單一技術較難直接實現三維立體結構。

4.3 冷凍干燥

冷凍干燥又稱升華干燥。將材料溶液的溫度降至冰點，再通過固體溶液升華制備成所需支架。Frydrych 等[63]通過冷凍干燥法制備得到了大而靈活的三維多孔PLLA 支架，具有高度互聯的開孔結構、91%～92%的高孔隙率及109～141 μm的孔徑。實驗證明，利用冷凍干燥法制作的PGS/PLLA 共混支架具有與天然脂肪組織相似的力學性能、理想的多孔結構及親水性能。凍干法的優點在于有利于創建大體積多孔的材料支架；缺點在于需要模具來限定材料形狀，且處理過程中無法保證樣品的原有生物活性。

5 總結與展望

以脂肪組織工程為基礎的乳房組織工程，旨在能夠恢復并長期保持與正常乳房組織相似的三維結構與生理功能，減少重建術后的并發癥，提升乳房的整形美容效果。支架材料及其制備工藝是乳房組織工程的關鍵環節。為了克服單組份材料的局限性，目前人體組織再生設計較為依賴于兩種或兩種以上材料的組合，如天然與合成材料結合。合成材料主要提供機械強度和可紡性，而支架組分中的天然材料提供細胞識別信號，對細胞存活和增殖至關重要。作為脂肪組織工程的理想種子細胞，對ADSCs 分化能力、免疫調節能力及缺損修復機制的研究也是乳房組織工程研究的關鍵。ADSCs 聯合DAT 具有良好的促進成脂和血管化能力，值得更加深入的研究與改良[41]。相信在臨床醫學、分子生物學、材料科學、理工科學等交叉學科的不斷合作中，組織工程必將成為乳房重建最為理想的修復方式。