蘇木4種提取物對脫礦牙釉質的再礦化作用

李茹芳， 崔 霞， 王麗梅， 李秋艷， 藍 海*

(1.大理大學藥學院，云南 大理 671000；2.云南省大理州人民醫院口腔科，云南 大理 671000)

蘇木為豆科云實屬植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材，最早記載于《唐本草》中，味甘、咸，性溫，具有松弛筋絡、活血散結、鎮靜止痛等功效[1]，主要分布在廣東、廣西、云南等地，其中廣西是主要的生產及栽培區。目前，國內外學者已從蘇木中分離出近100個化合物，主要包括蘇木素類、原蘇木素類、高異黃酮類等[2-3]。近年來，對蘇木提取物活性的研究主要集中在抗腫瘤[4-5]和免疫抑制[6]。課題組前期研究證實，蘇木乙醇、乙酸乙酯、正丁醇以及水提取物可以抑制變形鏈球菌和粘性放線菌的生長，但還沒有文獻報道蘇木是否有再礦化的作用。本實驗建立體外齲齒模型，通過給予前期實驗所得最低抑菌濃度(MIC)，研究蘇木4種提取物對牛切牙脫礦牙釉質再礦化的影響，初探蘇木的防齲機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 新鮮牛切牙(大理泰興市場)。氟化鈉(分析純，上海申博化工有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，天津市化學試劑研究所)；冰乙酸、氯化鉀(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)；HEPES緩沖液(美國Sigma公司)。

1.2 儀器 Leica TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；BK-POLR-透反射偏光顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)；CP224C型電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；YMP-2B型金相試樣磨拋機(蘇州歐卡精密光學儀器有限公司)；78HW-1型恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市億通電子有限公司)；DHP-9162型電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；SB-25-12DT型超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 釉質樣品制備

2.1.1 牙釉質制備 參考文獻[7]報道，取新鮮牛牙，去除軟組織，用硬組織切片機分離牙冠和牙根，采用磨拋機將牙冠表面拋光成光滑平面(開窗區為5 mm×5 mm)，超聲清洗30 min，去離子水洗凈，置于0.9% 氯化鈉溶液中，4 ℃下保存備用。

2.1.2 分組 在顯微鏡下觀察牙釉質樣品，選取無裂痕、齲損、氟斑的完好牙釉質，用去離子水洗凈晾干，隨機分為脫礦組、陰性組、陽性組(20 mg/mL 氟化鈉)及蘇木乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物組，每組6顆(實驗組用藥濃度為課題組前期實驗所得的變形鏈球菌MIC值2.5 mg/mL)。

2.2 脫礦和再礦化實驗 將釉質樣品全部浸入脫礦液[8](50 mmol/L乙酸、2.2 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、2.2 mmol/L二水合氯化鈣溶液、0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液，pH 4.5)中，置于37 ℃搖床中100 r/min脫礦72 h，用去離子水沖洗，形成人工齲齒。將人工脫礦后的釉質樣品在各實驗組溶液中浸泡5 min，去離子水沖洗干凈，濾紙吸干水分，放入酸性緩沖液[8](50 mmol/L乙酸、2.25 mmol/L二水合氯化鈣溶液、0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液、1.5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、130 mmol/L氯化鉀溶液，pH 5.0)中浸泡30 min，去離子水沖洗干凈，濾紙吸干水分，最后放入中性緩沖液[8](20 mmol/L HEPES緩沖液、2.25 mmol/L二水合氯化鈣、1.5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、130 mmol/L 氯化鈉溶液，pH 7.0)中浸泡10 min，去離子水沖洗干凈，濾紙吸干水分。每天重復6次，持續10 d，進行再礦化，其余時間在中性緩沖液中過夜，試劑每天更換[9]。

2.3 偏光顯微鏡觀察 參考文獻[10]報道，將經過脫礦和再礦化之后的牙釉質樣品進行包埋處理，在穩定的水流下，沿著釉質樣品開窗區的中央用硬組織切割機將其縱向切割成薄片，為完整的平面，切片為110 μm，每組取6片，樣品用甘油封片后在偏光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 按照“2.3”項下方法將牙釉質切割成110 μm薄片，每組6片，用0.1 mmol/L羅丹明B熒光染料染色1 h，蒸餾水沖洗多余染料，干燥后用甘油密封，并將其置于激光掃描共聚焦顯微鏡下，在529 nm激發波長下掃描，10倍鏡下觀察羅丹明B的滲入量[11]。用Image J v1.8.0軟件將掃描的圖像進行處理分析，并以熒光面積(單位為μm2)、總熒光量、平均熒光量3個參數表示[12]。

3 結果

3.1 偏光顯微鏡觀察 脫礦組和陰性組釉質樣品表面有許多病理損傷區域，形成不規則的表面缺陷，釉質層黑色區域明顯，存在以脫礦為主的正性雙折射區(紅色箭頭所示)。進行pH循環后，陽性組和蘇木4種提取物組釉質層相對完整，表面輕度脫鈣，脫礦區病變深度變淺(紅色箭頭所示)，并且齲損部位出現負性雙折射的再礦化帶(白色箭頭所示)，見圖1。

圖1 偏光顯微鏡觀察各組釉質齲再礦化作用

3.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 脫礦后紅色熒光強度較強，紅色條帶熒光面積較大；進行pH循環后，陽性組和蘇木4種提取物處理后的牙釉質熒光強度較弱，紅色條帶較細、短，紅色條帶熒光面積較小，見圖2。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各組釉質齲再礦化作用

3.3 蘇木4種提取物對牙釉質再礦化后激光掃描共聚焦顯微鏡參數的影響 如表1所示，與脫礦組比較，蘇木4種提取物組總熒光量、平均熒光量均減弱(P<0.05)。與陰性組比較，蘇木乙酸乙酯、正丁醇、水提取物總熒光量均降低(P<0.05)，蘇木正丁醇、水提取物組平均熒光量均降低(P<0.05)。蘇木各提取物再礦化作用生成的晶體使熒光染料進入牙組織脫礦釉質微孔中的量減少，齲損程度降低，具有再礦化作用。

4 討論

由于口腔環境結構的復雜多變，牙齒硬組織脫礦受多種因素影響。早期齲的自然形成時間一般為0.5～1.5年，因此無法直接在口腔內研究齲損的形成和再礦化機制。為了研究齲病的發生機制和預防措施，從20世紀50年代起人工齲實驗已被廣泛用于觀察和分析齲病的發生、發展和修復過程[13]。

表1 蘇木4種提取物對牙釉質再礦化后激光掃描共聚焦顯微鏡測量參數

人工齲的主要方法有體外法，包括化學齲法、電化學法、細菌產酸齲法和人工口腔模型。本實驗采用的化學致齲法是目前人工齲模型中最常用的方法，其優點是可以在控制變量的條件下研究單個因素的影響，從而得到牙齒硬組織表層和表層下脫礦及再礦化動力學變化的信息[14-15]。

偏光顯微鏡是研究牙體硬組織晶體結構的基本方法，通過偏振光的折射反映出釉質中具有雙折射特性的礦物質，可用于定性觀察脫礦和再礦化過程中晶體結構的變化[16]。本實驗發現，脫礦組和陰性組的釉質樣品因大量脫礦，齲損嚴重，呈現正性雙折射的暗帶，而樣品經過蘇木各提取物處理后，齲損厚度明顯變淺，密度變小并呈現負性雙折射的再礦化帶，表明蘇木各提取物均有抑制脫礦和促進再礦化的作用。

激光共聚焦顯微鏡是目前觀察牙齒硬組織脫礦和再礦化的一種先進方法，是生物學、醫學研究中最常用的熒光顯微工具之一，已經成為新的實驗手段，它解決了一些以往研究中存在的技術難題，創造更好的條件，在口腔硬組織定性和定量研究方面有很大的應用價值[17]。通過激光共聚焦顯微鏡測得齲損區域的熒光面積，總熒光量及平均熒光量可以了解標本脫礦及再礦化情況。牙釉質自身無法發熒光，需要使用羅丹明B等染料染色，經過激光共聚焦顯微鏡照射可發射熒光，然后利用Image J軟件進行定量分析。熒光染料分子可以滲進脫礦牙釉質的微孔中，脫礦區域的脫礦情況和總熒光量、平均熒光量成正比。實驗中熒光條帶代表脫礦部分，通過計算熒光條帶的總熒光量和平均熒光量，分析再礦化的效果[18]。本研究結果顯示，脫礦后紅色熒光強度較強，紅色條帶熒光面積較大；氟化鈉和蘇木各提取物處理后的牙片熒光強度較暗，紅色條帶較細、短，紅色條帶熒光面積較小，進一步說明蘇木提取物有促進牙釉質再礦化作用，從而達到防齲的效果。

綜上所述，蘇木作為一種抑菌殺菌能力強、對牙組織有再礦化效果的天然藥物，具有良好的應用前景和藥用價值。