大孔吸附樹脂分離純化紅禾麻總黃酮工藝的優化

孫開芬， 陳胤睿， 徐文芬， 舒燕霞， 石興雨

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

紅禾麻為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻Laporteabulbifera(Sieb. et Zucc.) Wedd.的新鮮或干燥全草，功效祛風除濕、活血化瘀、止痛、止癢，為貴州地方標準收載的少數民族苗族習用藥材，常鮮用以酒泡服，對類風濕性關節炎有較好的療效[1-4]，有著抗炎鎮痛[5-9]、抗風濕[10-12]、降脂[13]等作用，課題組前期研究表明，其提取物具有抗炎、抗氧化活性[14-15]。隨著對紅禾麻化學成分和藥理作用研究的不斷深入，發現黃酮是該藥材主要成分，而且對類風濕性關節炎具有較好的療效。

目前，大孔吸附樹脂以適用范圍廣、吸附量大、解析條件柔和、選擇性強、易于再生、成本低等優點[16]，被廣泛應用于中藥及民族藥中黃酮、生物堿、萜類、皂苷等常規的分離純化[17-22]，但目前尚無關于紅禾麻總黃酮的相關研究。因此，本實驗優化大孔吸附樹脂分離純化紅禾麻總黃酮工藝，以期為該成分藥理活性深入研究、相關新藥開發、相關制劑綠色制造奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 UV-1800型紫外分光光度儀(日本島津公司)；AG135電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；FA3204B電子分析天平(上海天美天平儀器有限公司)；R-215型旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；BS-1E振蕩和旋轉培養箱(常州市華普達教學儀器有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FN101-2A型電熱恒溫鼓風干燥箱(長沙儀器儀表廠)。

1.2 試劑與藥物 紅禾麻采自貴州省雷山縣，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻Laporteabulbifera(Sieb. et Zucc.) Wedd.的地上部分。蘆丁對照品(批號100080-201610，純度92.6%，中國食品藥品檢定研究院)。HP20、HPD300、HPD722型大孔吸附樹脂(鄭州和成新材料科技有限公司)；D101、AB-8型大孔吸附樹脂(上海藍季科技發展有限公司)。結晶氯化鋁(批號20170926，天津市科密歐化學試劑有限公司)。乙醇為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)；水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定 參考文獻[23]報道。

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品8.20 mg，置于25 mL量瓶中，70%乙醇溶解，制成質量濃度為0.303 7 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 顯色反應液制備 稱取結晶氯化鋁(AlCl3·6H2O)適量，加水溶解，定容至50 mL量瓶中，制成10% AlCl3溶液，即得。

2.1.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置于10 mL量瓶中，加入10% AlCl3溶液2 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻，40 ℃水浴顯色反應30 min，取出，搖勻，以相應試劑為空白，在406 nm波長處測定吸光度。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=27.3X-0.004 5(r=0.999 7)，在9.111～24.30 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.1.4 浸膏制備 稱取2.0 kg藥材粉末，30倍量70%乙醇回流提取1 h，濾過，濾渣用20倍量70%乙醇再回流提取1 h，濾過，合并濾液，旋轉蒸發儀回收溶劑得到稠浸膏，水浴蒸干，即得(共0.6 kg)。

2.1.5 測定方法 精密稱取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，搖勻，精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.3”項下方法加入顯色試劑，蒸餾水定容至刻度，40 ℃水浴顯色反應30 min，取出，搖勻，以相應試劑為空白，測定總黃酮含量，結果為2.111 mg/mL。

2.1.6 精密度試驗 取對照品溶液0.8 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.3”項下方法顯色，在406 nm波長處測定吸光度6次，測得其RSD為1.21%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，平行6份，按“2.1.3”項下方法顯色，在406 nm波長處測定吸光度，測得其RSD為1.78%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩定性試驗 精密稱取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，按“2.1.3”項下方法顯色，于0、2、4、6、12、24、48 h在406 nm波長處測定吸光度，測得其RSD為2.11%，表明溶液在48 h內穩定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取總黃酮含量已知的浸膏液6份，每份1 mL，分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對照品溶液，按“2.1.3”項下方法顯色，在406 nm波長處測定吸光度，計算回收率。結果，總黃酮平均加樣回收率為99.81%，RSD為0.98%。

2.2 樹脂預處理 取D101、AB-8、HPD300、HP20、HPD722樹脂適量，在95%乙醇中浸泡24 h使其充分溶脹，取出裝柱，95%乙醇以最大體積流量沖洗，蒸餾水以同樣體積流量沖洗至無醇味，收集洗凈樹脂，濾去水，備用。

2.3 靜態吸附研究

2.3.1 樹脂篩選 稱取預處理后抽濾至干的5種樹脂各3 g，平行3份，置于100 mL錐形瓶中。取浸膏1.5 g，加入50 mL蒸餾水，超聲溶解至無明顯顆粒，加入裝有樹脂的錐形瓶中，置于恒溫振蕩箱(25 ℃，120 r/min)中振蕩24 h，濾過，取續濾液，計算樹脂對總黃酮的吸附率、比吸附量，公式分別為吸附率=[(C0V0-C1V1)/C0V0]×100%、比吸附量=(C0V0-C1V1)/M(C0為吸附前總黃酮初始質量濃度，V0為吸附前上樣液體積，C1為吸附后總黃酮質量濃度，V1為吸附后溶液體積，C2為解吸后總黃酮質量濃度，V2為解吸后溶液體積，M為樹脂質量)。將吸附飽和的樹脂用適量水沖洗，濾干，置于100 mL錐形瓶中，加入70%乙醇50 mL，置于恒溫振蕩箱中振蕩24 h，進行靜態解吸，計算樹脂對總黃酮的解吸率、比吸附量，公式分別為解吸率=[C2V2/(C0V0-C1V1)]×100%、比解吸量=C2V2/M，結果見表1。由此可知，D101型樹脂對總黃酮的吸附率、比吸附量、解吸率、比解吸量最高，故選擇其用于總黃酮富集純化。

2.3.2 靜態吸附曲線繪制 取預處理后抽濾至干的D101型樹脂約3 g，精密稱定，共14份，置于100 mL錐形瓶中，取浸膏1.5 g，50 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，加入裝有樹脂的錐形瓶中，置于恒溫振蕩箱(25 ℃、120 r/min)中振蕩，于30、60、90、120、180、240、300、360、460、660、860、1 060、1 260、1 440 min各取出1個錐形瓶，測定總黃酮質量濃度，繪制靜態吸附曲線，見圖1。由此可知，樹脂吸附過程發生了3個階段變化，并在360 min后逐漸達到平衡：第一階段，吸附能力在前120 min內呈線性快速上升趨勢；第二階段，在120～360 min時吸附能力增加較緩慢；第三階段，在360 min后樹脂達到吸附平衡。

圖1 D101型樹脂靜態吸附曲線

2.4 動態吸附研究

2.4.1 泄露曲線繪制 取預處理后的D101型樹脂約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏6.0 g，加入200 mL蒸餾水超聲溶解至無明顯顆粒，以1.0 mL/min體積流量上樣，每10 mL收集1份流出液，測定406 nm波長處吸光度，計算總黃酮質量濃度，繪制泄露曲線，當流出液中該成分質量濃度為上樣液的1/10時，可認為達到泄露點[24]，結果見圖2。總黃酮初始質量濃度為2.111 mg/mL，在第5份流出液中為0.233 4 mg/mL，即已達到泄露點，故選擇上樣體積為50 mL。

圖2 總黃酮在D101型樹脂上的泄露曲線

2.4.2 上樣液質量濃度對動態吸附性能的影響 精密稱取預處理好的D101型樹脂6份，每份10 g(濕質量，柱床體積約為19 mL)，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏0.4、0.7、1.0、1.2、1.5、2.0 g，超聲溶解于50 mL蒸餾水中，以1.0 mL/min體積流量上樣，動態吸附4 h后，加入3 BV(1 BV=19 mL)蒸餾水于吸附柱中進行水洗，收集未吸附液與水洗液，測定406 nm波長處吸光度，計算總黃酮吸附率、比吸附量，結果見圖3。由此可知，總黃酮吸附率隨著上樣液質量濃度增加而降低，而比吸附量恰好相反；當其質量濃度達到2.111 mg/mL后，相同時間動態吸附使其吸附率趨于平衡狀態。由于上樣液質量濃度太低不足以使樹脂吸附飽和，而太高又會浪費浸膏和試劑，最終確定其質量濃度不超過2.200 mg/mL，浸膏質量約為1.5 g。

圖3 不同上樣液質量濃度下總黃酮吸附率、比吸附量

2.4.3 上樣體積流量對動態吸附性能的影響 取預處理后的D101型樹脂約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共4份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸餾水中，超聲溶解至無明顯顆粒，分別以1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min體積流量上樣，動態吸附4 h后加入3 BV蒸餾水于吸附柱中，對樹脂進行水洗，收集未吸附液與水洗液，測定406 nm波長處吸光度，計算上樣液質量濃度吸附率，結果見圖4。由此可知，上樣體積流量為1 mL/min 時，會造成樹脂柱堵塞，不利于吸附(提取液中富含多糖而較黏稠)；為4 mL/min時，樹脂柱不易堵塞，而且增加了動態吸附次數，使吸附率最高，達87.25%。最終確定，上樣體積流量為4 mL/min。

圖4 不同上樣體積流量下總黃酮吸附率

2.4.4 徑高比對動態吸附性能的影響 取預處理后的D101型樹脂約7、10、12、15 g(濕質量，柱床體積約13、19、22、27 mL)，精密稱定，共4份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比分別為1∶5、1∶7、1∶8、1∶10，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸餾水中，超聲溶解至無明顯顆粒，以4.0 mL/min體積流量通過樹脂柱，動態吸附4 h后加入3 BV蒸餾水，對樹脂進行水洗，收集未吸附液與水洗液，測定406 nm波長處吸光度，計算總黃酮吸附率、比吸附量。結果，不同徑高比下總黃酮吸附率分別為76.64%、85.56%、88.44%、90.87%，比吸附量分別為11.560、9.031、7.779、6.395 mg/g，即徑高比為1∶5時雖然比吸附量最大，但吸附率最低，吸附不完全，而隨著徑高比增加比吸附量逐漸減小，說明徑高比越小，對浸膏和試劑浪費越多；徑高比越大，樹脂吸附越不飽和，對樹脂浪費越多。最終確定，徑高比為1∶7。

2.4.5 水洗用量對樹脂動態解吸率的影響 取預處理后的D101型樹脂約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共5份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g至50 mL蒸餾水中，超聲處理至無明顯顆粒，以4.0 mL/min體積流量通過樹脂柱，動態吸附4 h后分別加入3、6、9、12、15 BV蒸餾水洗脫，收集水洗液，測定406 nm波長處吸光度，計算總黃酮含量，結果見圖5。由此可知，水洗用量為3～9 BV時，總黃酮含量平穩；為9～12 BV時，其含量明顯升高，但繼續加大時可能會對已被樹脂吸附的該成分造成一定損失。最終確定，水洗用量為9 BV。

圖5 不同水洗用量下總黃酮含量

2.4.6 洗脫劑體積分數對總黃酮洗脫量的影響 取預處理后的 D101型樹脂約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g，置于50 mL蒸餾水中，超聲溶解至無明顯顆粒，以4 mL/min體積流量上樣，動態吸附4 h后加入9 BV蒸餾水除雜，依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇及無水乙醇各3 BV梯度洗脫，分段收集洗脫液，測定406 nm波長處吸光度，計算總黃酮洗脫量，結果見圖6。由此可知，5%乙醇就可逐漸洗脫總黃酮，30%、40%乙醇能將大部分該成分洗脫出來，80%、90%、無水乙醇幾乎洗脫不出。綜合考慮對總黃酮的最大富集效果及對溶劑的綠色節約，最終確定洗脫劑(乙醇)體積分數為70%。

圖6 不同體積分數洗脫劑下總黃酮洗脫量

2.4.7 洗脫劑用量對總黃酮洗脫效果的影響 取預處理后的D101型樹脂約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共5份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g，溶于50 mL蒸餾水中，將2.111 mg/mL總黃酮溶液以4 mL/min體積流量上樣，動態吸附4 h后用9 BV蒸餾水除雜，再分別用3、6、9、12、15 BV 70%乙醇以1 mL/min體積流量洗脫，收集洗脫液，測定406 nm波長處吸光度，計算洗脫率。結果，不同洗脫劑用量下洗脫率分別為82.49%、87.34%、91.78%、97.65%、97.57%，即總黃酮洗脫效果隨著洗脫劑用量增加而逐漸加強，當其用量為12 BV時達到平衡。最終確定，洗脫劑(70%乙醇)用量為12 BV。

2.4.8 洗脫劑體積流量對總黃酮洗脫效果的影響 取預處理后的D101型樹脂約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，共4份，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，取浸膏1.5 g溶于50 mL蒸餾水中，以4 mL/min體積流量上樣，動態吸附4 h后，9 BV蒸餾水除雜，再用12 BV 70%乙醇以1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min體積流量洗脫，收集洗脫液，測定406 nm波長處吸光度，計算洗脫率。結果，不同洗脫劑體積流量下洗脫率分別為87.04%、84.51%、79.43%、75.38%，即總黃酮洗脫率隨著洗脫劑體積流量增加而降低，為3、4 mL/min時，不利于洗脫溶液與總黃酮之間的相互作用，而且時間較短，導致洗脫率較低；為1 mL/min時，延長了洗脫劑與總黃酮的作用時間，從而洗脫率最高。最終確定，洗脫劑體積流量為1 mL/min。

2.4.9 驗證試驗 根據上述單因素試驗，確定最優工藝為D101型樹脂10 g，浸膏質量1.5 g(總黃酮質量濃度約為2.111 mg/mL)，上柱體積50 mL，上樣體積流量 4 mL/min，徑高比1∶7，洗脫時先以9 BV蒸餾水除雜，再用12 BV 70%乙醇洗脫，洗脫體積流量為1 mL/min。稱取5份預處理后的D101型樹脂，每份約10 g(濕質量，柱床體積約19 mL)，精密稱定，濕法緩慢裝入吸附柱(1.5 cm×34 cm)中，徑高比為1∶7，吸取2.111 mg/mL總黃酮溶液50 mL，以4 mL/min體積流量上樣，待吸附飽和后用9 BV蒸餾水除雜，再用12 BV 70%乙醇以1.0 mL/min體積流量洗脫，收集洗脫液，計算總黃酮洗脫量、洗脫率，結果見表2。由此可知，優化工藝對總黃酮具有較好的分離富集效果，D101型樹脂可大大提高該成分純度。

表2 驗證試驗結果(n=5)

3 討論

本實驗考察5種大孔吸附樹脂對紅禾麻總黃酮的吸附、解吸性能，發現非極性樹脂(HPD300、HP20、D101型)吸附率、解吸率高于弱極性樹脂(AB-8、HPD722型)。再通過靜態吸附解析實驗發現，D101型大孔吸附樹脂的效果最好，故選擇其進行單因素試驗。

黃酮為紅禾麻活性成分，具有抗炎、抗氧化活性[15]，但不同批次之間該成分含量差異較大，僅以其為指標評價藥材品質過于片面，故本實驗選擇總黃酮作為研究對象。前期預實驗考察了體積流量5 mL/min對總黃酮含量的影響，發現上樣液黏稠，即使將吸附柱控制閥調至完全也不能得到該數值，最高僅接近于4 mL/min，故本實驗只考察了1、2、3、4 mL/min。驗證試驗結果顯示，紅禾麻總黃酮質量分數從7.04%升至23.89%，固形物含量由1.50 g減少至0.38 g，表明大孔吸附樹脂純化工藝合理可行，可用于后期相關研究。