黃芩素通過抑制NF-κB通路對(duì)小鼠燒傷愈合的促進(jìn)作用

徐俊濤， 王 瑩， 馬 飛， 王 麗， 方玉甫， 劉愛民

(1.河南省中醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450002；2.中山大學(xué)第六附屬醫(yī)院新生兒科，廣東 廣州 510655)

燒傷是急救醫(yī)學(xué)中最主要的疾病之一，嚴(yán)重?zé)齻蓪?dǎo)致身體和心理上的傷疤和慢性殘疾[1]，可引起一系列問題，包括壞死、創(chuàng)傷、成纖維細(xì)胞損傷、炎癥、血液和淋巴毛細(xì)血管淤滯、膠原大量產(chǎn)生等[2]，當(dāng)前治療藥物包括抗生素、消炎藥、銀鹽，但具有多種缺點(diǎn)和不良反應(yīng)[3]。黃芩素是一種黃酮化合物，最初來源于黃芩的根和黃芩苷的苷元[4]，具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎癥、神經(jīng)保護(hù)作用[5]，能促進(jìn)皮膚隨機(jī)皮瓣存活[6]，但其在燒傷中的作用還有待進(jìn)一步探究。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子等的表達(dá)，在感染引起的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[7]。本研究旨在探究黃芩素對(duì)小鼠燒傷愈合的治療作用，以及其涉及的主要機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 8～12周齡雄性BALB/c小鼠購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2019-028。實(shí)驗(yàn)獲得河南省中醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與藥物 胎牛血清(批號(hào)1237698)、DMEM(批號(hào)8128032)購自美國Gibco公司；膜聯(lián)蛋白V-碘化丙啶(Annexin V-PI)雙染凋亡試劑盒(批號(hào)20150314)購自美國BD公司；二甲基亞砜(DMSO，貨號(hào)D8418)、黃芩素(純度>98%，貨號(hào)465119)、鼠源TNF-α重組蛋白(貨號(hào)H8916)購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒(貨號(hào)ab228554)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2，貨號(hào)ab182858)、caspase-3(貨號(hào)ab184787)、白介素-6(IL-6，貨號(hào)ab229381)、白介素-1β(IL-1β，貨號(hào)ab254360)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2，貨號(hào)ab181286)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9，貨號(hào)ab228402)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB，貨號(hào)ab239882)、總NF-κB(t-NF-κB，貨號(hào)ab207297)、β-actin(貨號(hào)ab8227)抗體購自英國Abcam公司；磷酸化NF-κB抑制蛋白-α(p-IκBα，貨號(hào)2859)、總IκBα(t-IκBα，貨號(hào)4812)購自美國Cell Signaling Technology公司；所有二抗均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器 超凈工作臺(tái)(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；凝膠成像儀(加拿大Carestream公司)；光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 小鼠燒傷模型建立 雄性BALB/c小鼠用戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，剃掉背部毛發(fā)，暴露皮膚，將預(yù)熱到165 ℃的銅塊(2 cm×2 cm，150 g)接觸皮膚區(qū)域10 s(不對(duì)銅塊施加額外壓力，以確保使用相似壓力造成每次燒傷)。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，燒傷組，20、50 mg/kg黃芩素組，黃芩素(50 mg/kg)+TNF-α重組蛋白(5 μg/kg)組，每組8只，給藥組小鼠每隔2 d腹腔注射相應(yīng)劑量藥物，持續(xù)14 d。在第0～14天，每隔2 d對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，由2名研究人員采用IPP 6.0軟件對(duì)創(chuàng)面面積進(jìn)行分析，并在第14天處死小鼠，計(jì)算傷口面積，公式為傷口面積=(殘余創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積)×100%。

2.2 組織學(xué)分析 在燒傷第8天將小鼠處死，用組織剪沿?zé)齻麆?chuàng)面邊緣5 mm的位置取正方形組織塊，厚度為皮膚全層，置于10%福爾馬林緩沖液中固定至少24 h，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，切成5 μm厚切片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡(×100)下觀察組織病理形態(tài)變化。

2.3 原代皮膚成纖維細(xì)胞制備及培養(yǎng) 小鼠剃毛后處死，置于75%乙醇中浸泡10 min，PBS沖洗3次，取背部皮膚，去除血管脂肪等多余組織，PBS沖洗3次，切成小塊，加入0.05%胰酶消化液消化1 h，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，PBS清洗細(xì)胞懸液，均勻鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，并加入含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞熱刺激 將原代小鼠成纖維細(xì)胞置于熱水器水箱中，在52 ℃下孵育30 s，隨后放到正常環(huán)境中培養(yǎng)。

2.5 給藥 細(xì)胞經(jīng)熱刺激后，分別用20、50 μmol/L黃芩素干預(yù)細(xì)胞48 h；或細(xì)胞經(jīng)熱刺激后，用50 μmol/L黃芩素、100 ng/mL TNF-α重組蛋白共同干預(yù)細(xì)胞48 h。

2.6 細(xì)胞凋亡檢測 按“2.5”項(xiàng)下方法給藥48 h后，PBS清洗細(xì)胞3次，重懸于含Annexin V-FITC、PI各10 μL的結(jié)合緩沖液中，室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞增殖檢測 將原代皮膚成纖維細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板，按“2.5”項(xiàng)下方法給藥，在正常條件下分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，隨后在每孔加入10 μL CCK8試劑并混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm波長處的光密度(OD)值，計(jì)算增殖率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 Western blot檢測蛋白相對(duì)表達(dá) 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞或組織中的蛋白，取20 μL進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳(120 V，2 h)，電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(250 mA，2 h)，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗在4 ℃下過夜孵育，加入二抗室溫孵育2 h。采用凝膠成像儀曝光蛋白條帶，Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 黃芩素抑制熱刺激對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥因子的作用 如圖1所示，與對(duì)照組比較，皮膚成纖維細(xì)胞受熱刺激后，細(xì)胞增殖率、抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)，促凋亡因子caspase-3、炎癥因子(IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9)蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與熱刺激組比較，20、50 μmol/L黃芩素處理能增加細(xì)胞增殖能力以及Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05，P<0.01)，降低caspase-3、IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。

注：A～B為細(xì)胞凋亡情況，C為細(xì)胞增殖能力，D～F為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，G～K為細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與熱刺激組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 黃芩素抑制熱刺激誘導(dǎo)的NF-κB通路 如圖2所示，與對(duì)照組比較，皮膚成纖維細(xì)胞受熱刺激后，p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與熱刺激組比較，20 、50 μmol/L黃芩素能抑制p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。

注：A為細(xì)胞蛋白條帶圖，B～C為細(xì)胞p-NF-κB、p-IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與熱刺激組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 黃芩素通過NF-κB通路抑制熱刺激對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥因子的作用 與熱刺激組比較，50 μmol/L黃芩素處理能抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05)，下調(diào)p-NF-κB、p-IκBα、caspase-3、IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)(P<0.05)，增加細(xì)胞增殖和Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)；與50 μmol/L黃芩素組比較，100 ng/mL TNF-α(NF-κB通路激活劑)重組蛋白處理可逆轉(zhuǎn)黃芩素的作用，見圖3。

注：A～C為細(xì)胞NF-κB、IκBα蛋白表達(dá)，D～E為細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)～H為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，I為細(xì)胞增殖能力，J～N為炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與熱刺激組比較，#P<0.05；與50 μmol/L黃芩素組比較，$P<0.05。

3.4 黃芩素通過NF-κB通路促進(jìn)小鼠燒傷恢復(fù) 與燒傷組比較，50 mg/kg黃芩素干預(yù)能促進(jìn)燒傷愈合(P<0.05)，5 μg/kg TNF-α則抑制50 mg/kg黃芩素對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用(P<0.05)。在燒傷后第8天，燒傷組表皮結(jié)構(gòu)不完整，明顯增厚，表皮附近細(xì)胞數(shù)較其他2組減少，并觀察到瘢痕形成；50 mg/kg黃芩素組有少量毛囊形成，纖維組織排列較整齊，開始形成較完整的表皮；50 mg/kg黃芩素和5 μg/kg TNF-α共處理組表皮附近細(xì)胞數(shù)較燒傷組增多，表皮厚度較黃芩素組厚。與對(duì)照組比較，燒傷組織中IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與燒傷組比較，20、50 mg/kg黃芩素干預(yù)能降低燒傷組織中IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；與50 mg/kg黃芩素組比較，5 μg/kg TNF-α處理能升高IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)。見圖4。

注：A為燒傷面積統(tǒng)計(jì)，B為燒傷組織HE染色(×100)，C～I(xiàn)為細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與燒傷組比較，#P<0.05，##P<0.01；與50 mg/kg黃芩素組比較，$P<0.05。

4 討論

燒傷至今仍是世界上導(dǎo)致死亡和殘疾的重要原因之一，其愈合過程是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一大挑戰(zhàn)。盡管先進(jìn)的臨床護(hù)理技術(shù)使燒傷病人死亡率有所下降，但仍面臨許多問題，如燒傷感染、傷口愈合延遲和肥厚性瘢痕形成等[8]。傳統(tǒng)中藥具有副作用小，成本低的優(yōu)勢，已被選作燒傷治療的替代藥物或輔助藥物[9]。

皮膚成纖維細(xì)胞是組成皮膚真皮的主要結(jié)構(gòu)成分，是傷口愈合過程中最重要的細(xì)胞成分之一，它們通過增殖、遷移、膠原形成和細(xì)胞因子分泌影響皮膚功能[10-11]。正常情況下，皮膚成纖維細(xì)胞維持一定的增殖和代謝速率，并分泌一定量的基質(zhì)和細(xì)胞因子以維持皮膚完整性和正常代謝。然而，在燒傷等環(huán)境壓力下，成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出異常行為，包括增殖速度加快，炎性細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多[12]。本研究中，小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞受熱刺激后，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖能力降低，且促炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9)分泌增加。此外，熱刺激還可激活皮膚成纖維細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路。

黃芩素具有抗炎和抗氧化作用。Lin等[6]發(fā)現(xiàn)，黃芩素能促進(jìn)皮膚隨機(jī)皮瓣存活，這與增強(qiáng)血管生成，減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。黃芩素通過影響Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號(hào)刺激血管生成，通過增強(qiáng)抗氧化因子活性抑制氧化應(yīng)激，通過調(diào)節(jié)磷酸肌醇三激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)抑制細(xì)胞凋亡[13-14]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子控制多種生理過程，包括炎癥、免疫、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和血管生成[15]。黃芩素通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抗炎作用[16]。研究表明，TNF-α在體內(nèi)外均能很好地激活NF-κB,可以作為NF-κB信號(hào)通路的陽性激活劑。本研究顯示，20、50 μmol/L黃芩素干預(yù)均可逆轉(zhuǎn)熱刺激誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞凋亡增加，增殖減少，炎性細(xì)胞因子分泌增加，NF-κB通路激活；而100 ng/mL TNF-α重組蛋白干預(yù)逆轉(zhuǎn)了黃芩素對(duì)熱刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，提示黃芩素發(fā)揮其功能主要通過抑制NF-κB信號(hào)通路活性。

研究表明，多種傳統(tǒng)中藥對(duì)小鼠燒傷愈合具有促進(jìn)作用，如石榴皮提取物促進(jìn)大鼠深度二級(jí)燒傷創(chuàng)面愈合，具有較強(qiáng)抗菌活性[17]。黃芩素已被報(bào)道在促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原合成中發(fā)揮重要作用[18]。此外，黃芩素可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)途徑減輕肥厚性瘢痕的形成[19]。本研究顯示，50 mg/kg黃芩素腹腔注射能降低燒傷組織中炎性細(xì)胞因子和促凋亡因子蛋白表達(dá)，升高抗凋亡因子表達(dá)，且可促進(jìn)小鼠燒傷傷口愈合；而5 μg/kg TNF-α重組蛋白腹腔注射則抑制了黃芩素對(duì)燒傷愈合的促進(jìn)作用，提示黃芩素主要通過抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)小鼠燒傷恢復(fù)。

綜上所述，黃芩素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路，緩解熱刺激對(duì)原代小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的損傷，促進(jìn)小鼠燒傷愈合。