侵染湖北圓葉牽牛的甘薯曲葉病毒分子鑒定及遺傳進化分析

羅婉笛 ，王鵬，莫翠萍，蔡健和，章松柏，李戰彪

（1.長江大學農學院/農林病蟲害預警與調控湖北省工程技術研究中心，湖北 荊州 434025；2.廣西農業科學院植物保護研究所/農業農村部華南果蔬綠色防控重點實驗室/廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西 南寧 530007）

【研究意義】雙生病毒（Geminiviridae）是一類單鏈環狀DNA 病毒，病毒粒體為雙聯體結構，包裹1 條或2 條單鏈環狀基因組DNA，長度為2.5～3.0 kb［1］。雙生病毒主要侵染雙子葉植物，可危害棉花、甘薯、番茄、煙草等多種經濟作物［2］。雜草是其重要的中間寄主，在雙生病毒的重組及進化過程中起著重要作用，同時，雜草寄主也為雙生病毒的蔓延擴散提供重要中間過渡［3-4］。因此，監測雜草上的雙生病毒對作物雙生病毒的防控具有重要意義。【前人研究進展】雙生病毒根據其基因組特征、寄主范圍及傳播媒介等特征被劃分為14 個屬：分別為菜豆金色黃花葉病毒屬（Begomovirus）、玉米線條病毒屬（Mastrevirus）、曲項病毒屬（Curtovirus)、番茄偽曲項病毒屬（Topocuvirus)、甜菜曲項病毒 屬（Becurtovirus）、蕪菁曲項病毒屬（Turncurtovirus）、畫眉草病毒屬（Eragrovirus）、葡萄紅斑病毒屬（Grablovirus）、大戟小刺潛伏病毒屬（Capulavirus）和5 個新屬：Citlodavirus、Maldovirus、Mulcrilevirus、Opunvirus和Topilevirus，其中，菜豆金色黃花葉病毒屬（Begomovirus）是最具經濟重要性的一個病毒屬，據不完全統計該屬病毒至少有445種［5-6］。甘薯雙生病毒（sweepoviruses）是侵染甘薯的菜豆金色黃花葉病毒屬的總稱，已報道有14 種可侵染甘薯，而侵染我國甘薯的至少有10種［7］，甘薯曲葉病毒（Sweet Potato Leaf Curl Virus，SPLCV）是其中一個重要種［8］。由SPLCV 引起的甘薯曲葉病是限制世界甘薯生產的主要病毒病害之一，該病20 世紀80 年代在中國臺灣、日本等地區和國家甘薯上發現，目前已遍及美洲、非洲、歐洲和亞洲［9］。在我國，SPLCV 已在遼寧［10］、廣東［11］、福建［12］、江蘇［13］、云南［14］和湖南［15］等地甘薯或牽牛花上得到鑒定。【本研究切入點】甘薯是湖北重要的糧食作物，病毒病的肆虐嚴重危害甘薯產業的健康發展。據報道，侵染湖北甘薯的雙生病毒主要有甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet Potato Feathery Mottle Virus，SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒（Sweet Potato Chlorotic Stunt Virus，SPCSV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）和佐治亞甘薯曲葉病毒（SPLCGV）等4種［16］，但這些病毒在湖北的發生流行規律仍不清楚。2021年9 月，課題組在調查中發現，湖北荊州的圓葉牽牛表現黃脈、葉片卷曲等疑似雙生病毒的典型癥狀，而明確其病原將為該病的防治提供理論支撐。【擬解決的關鍵問題】本研究擬通過分子生物學手段，對疑似雙生病毒侵染的圓葉牽牛進行檢測、鑒定，明確引發該類癥狀的病毒病原，并利用分段克隆、序列比對和遺傳進化分析等方法獲得相關病毒病原的全基因組序列和遺傳進化規律，研究結果將為雙生病毒的綜合防控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021 年9 月從湖北省荊州市市郊田間采集表現黃脈、葉片卷曲等疑似雙生病毒典型癥狀的圓葉牽牛植株葉片，葉片樣品經液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.2 植物葉片總DNA 的提取

采用CTAB法［17］提取圓葉牽牛總DNA：取100 mg 葉片樣品于液氮中研磨成粉末，加入65 ℃預熱的CTAB 緩沖液，然后分別加入氯仿-異戊醇（24 ∶1）、異丙醇進行抽提，沉淀用75%無水乙醇洗滌2 次，最后將DNA 沉淀溶解于50 μL的ddH2O 中，于-20 ℃下保存備用。

1.3 PCR 檢測

利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的通用引物PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′［18］，以圓葉牽牛葉片總DNA 為模板進行PCR 檢測。反應體系為24 μL：0.5 μL DNA模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，12 μL 2×HiFiTaqPCR StarMiX，ddH2O 補足至24 μL。反應程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環36 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

菌落PCR 反應體系為12 μL：上游和下游引物M13-47F/M13-47R（10 μmol/L）各0.5 μL，6 μL 2×HiFiTaqPCR StarMiX，ddH2O 5 μL，滅菌槍頭挑取單菌落作為模板溶解于PCR 反應體系中。擴增程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環36 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 圓葉牽牛中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的全基因組序列克隆

參考NCBI 已經登錄的甘薯曲葉病毒（SPLCV）全基因序列（登錄號KY783941），設計可以擴增SPLCV 基因序列的特異PCR 引物SPLCV-1F：5′-TTCGCGGAGATTTCATCCCTATG-3′，SPLCV-R：5′-GCAACAGTGCTTGGTATAACGTC-3′；SPLCV-2F：5′-TACAGTTGGATTGCCAGTCCTTC-3′，SPLCV-2R：5′-GTGGGTTCTGCAAAGGATCCCAC-3′。反應體系為24 μL：0.5 μL DNA 模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，12 μL Taq 酶（2×HiFiTaqPCR StarMiX），ddH2O 補足至24 μL。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行切膠純化。

PCR 產物經DNA 凝膠回收試劑盒（OMEGA）回收，回收純化后的PCR 產物連接至pMD19-T克隆載體上，轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養基上37 ℃培養12～16 h，挑取菌落，經菌落PCR 鑒定后，選取陽性克隆送武漢華大基因有限公司進行測序。菌落PCR 反應體系為12 μL：上游和下游引物M13-47F、M13-47R（10 μmol/L）各1.0 μL，6 μL 2×HiFiTaqPCR StarMiX，ddH2O 4 μL，滅菌槍頭挑取單菌落作為模板溶解于PCR 反應體系中。擴增程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，循環36 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 序列分析和進化樹構建

測序所得的序列采用DNASTAR Lasergene 7.1 軟件進行拼接，利用DNAMAN 和DNASTAR Lasergene 7.1 預測病毒基因組序列的開放閱讀框（ORF），利用SDT 軟件對序列的核苷酸相似性進行分析，利用MEGA 7.0 最大似然法（Maximum Likelihood Estimation,MLE）構建進化樹，步值設置為1 000。

2 結果與分析

2.1 田間病株癥狀

2021 年9 月在湖北省荊州市市郊田間發現表現為黃脈、葉片卷曲等疑似雙生病毒典型癥狀的圓葉牽牛植株，其發病癥狀見圖1。

圖1 SPLCV 侵染的圓葉牽牛癥狀Fig.1 Symptoms of Ipomoea purpurea (L.) infected by SPLCV

2.2 圓葉牽牛中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的PCR 檢測結果

利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒通用引物（PA、PB）對圓葉牽牛葉片總DNA 進行擴增［19］，結果（圖2）發現，從染病的圓葉牽牛總DNA 中擴增出一條363 bp 的目的DNA 片段，健康圓葉牽牛總DNA未見特異擴增。將目的PCR條帶回收、克隆并進行序列測定［20］，所得序列在NCBI 上使用BLASTn 工具進行比對分析，結果發現所得序列與GenBank 上已報道的甘薯曲葉病毒各分離物的相似性在94%～97%之間，其中與甘薯曲葉病毒湖南分離物（GenBank 登錄號：KY783941）的部分核苷酸序列相似性最高，達到97.52%。表明檢測陽性的圓葉牽牛葉片樣品受到了雙生病毒的侵染，其病原可能是甘薯曲葉病毒（SPLCV）。

圖2 SPLCV 侵染的圓葉牽牛葉片樣品PCR 檢測結果Fig.2 PCR detection results of Ipomoea purpurea (L.)leaf samples infected by SPLCV

2.3 湖北圓葉牽牛SPLCV 基因組全序列克隆及分析

為了獲得圓葉牽牛中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的全長基因組，以圓葉牽牛葉片總DNA 為模板，利用特異性引物SPLCV-1F/SPLCV-1R、SPLCV-2F/SPLCV-2R 分別進行PCR擴增，所得的PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析［21］，結果（圖3）顯示，從圓葉牽牛葉片總DNA 中獲得兩條大小分別為1 613 bp 和1 260 bp的PCR 產物條帶，PCR 產物經純化后克隆至pMD19-T 載體上，挑選陽性克隆子進行序列測定，所得序列經拼接后共獲得2 827 bp的有效序列，使用DNAMAN 對所得序列進行分析發現，所得序列含有AV1、AV2、AC1、AC2、AC3 和AC4 等6 個開放閱讀框，其中病毒鏈編碼AV2（125～469 nt）和AV1（294～1058 nt）兩個ORF，互補鏈編碼AC1（1580～2674 nt）、AC2（1225～1671 nt）、AC3（1074～1508 nt）和AC4（2260～2517 nt）4 個ORF。

圖3 SPLCV 基因序列PCR 檢測結果Fig.3 PCR detection electropherogram results of SPLCV gene sequence

將本研究所得序列與GenBank 中已報道的序列進行比對分析發現，本研究獲得的序列與GenBank 中SPLCV 各分離物的核苷酸相似性均在91%以上，其中與SPLCV 湖南分離物（GenBank登錄號：KY783941）、韓國分離物（GenBank 登錄號：HM754637）和韓國另一分離物（GenBank登錄號：HM754641）的核苷酸序列相似性分別為97.52%、96.01% 和95.66%。根據國際病毒分類委員會對菜豆金色黃花葉病毒的分類標準［22］，病毒DNA-A 的核苷酸相似性＞ 91%則認為是同種病毒，因此，侵染湖北圓葉牽牛的雙生病毒為SPLCV，命名為SPLCV-HB（GenBank 登錄號：OM287440）。選取SPLCV 不同分離物進一步利用SDT 軟件進行核苷酸相似性比對分析發現，本研究所獲得的SPLCV-HB 分離物的核苷酸序列與用于分析的各SPLCV 分離物的核苷酸相似性大部分在94%～99%之間，但與SPLCV -spain 分離的核苷酸相似性僅為91%，從圖4 可以看出，所選取的SPLCV 的分離物與SPLCV-spain 分離物均具有較低的核苷酸相似性。

圖4 SPLCV 湖北分離物與其他SPLCV 分離物相似性比對結果Fig.4 Similarity comparison of SPLCV Hubei isolate and other SPLCV isolates

2.4 SPLCV-HB 分離物的進化樹分析

為分析SPLCV-HB 分離物與已報道的SPLCV各分離物的親緣關系，利用MEGA 7.0 將本研究獲得的SPLCV-HB 序列與20 個SPLCV 分離物序列采用最大似然法（MLE）對SPLCV 構建進化樹。從進化樹圖（圖5）可以看出，一共分為兩個大支，本研究得到的SPLCV-HB 分離物（GenBank 登錄號：OM287440）與國內和國外部分地區處于同一分支，其中與SPLCV湖南分離物（GenBank登錄號：KY783941）聚在同一個小分支，表明與湖南分離物有較近親緣關系，與之聚集在同一分支的還有SPLCV 韓國各分離物和江蘇分離物，這些分離物均來自東亞地區，而另一大的分支里有SPLCV 西班牙分離物、SPLCV 巴西分離物以及SPLCV 秘魯分離物等，也有SPLCV 美國分離物與SPLCV 韓國分離物，但絕大多數分離物來自南美地區。

圖5 基于SPLCV 湖北分離物與其他20 個分離物的全基因序列構建的系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SPLCV Hubei isolate and other 20 isolates based on complete gene sequence

3 討論

本研究對湖北省荊州市市郊表現典型黃脈癥狀的圓葉牽牛進行鑒定后證實，圓葉牽牛植株受到雙生病毒的侵染，進一步利用分子克隆獲得侵染圓葉牽牛的雙生病毒的全基因組序列，該序列具備菜豆金色黃花葉病毒屬的典型特征，且與GenBank 已登錄的SPLCV 各分離物的核苷酸相似性均在91%以上，其中與SPLCV-HuNan（GenBank 登錄號：KY783941）的相似性最高，達97.52%，根據國際病毒分類委員會對菜豆金色黃花葉病毒的分類標準［22］，確定侵染湖北圓葉牽牛的雙生病毒為SPLCV，本研究是SPLCV 侵染湖北牽牛花的首次報道。

通過進化樹進一步分析發現，SPLCV-HB 分離物與國外和國內的部分地區處于同一分支，其中與SPLCV 湖南分離物處于同一個小分支，說明它們之間有較近的親緣關系，另外本研究分離物與SPLCV 韓國各分離物和江蘇分離物處于一個分支，分析發現與本研究分離物（GenBank 登錄號：OM287440）聚集在一個分支的SPLCV 各分離物大多來自東亞地區，而沒有與本研究聚集在一起的另一分支則大多來自南美地區，這些結果表明SPLCV 的分布具有地域差異性。

SPLCV 是限制世界甘薯生產的主要病毒病害之一，該病早在20 世紀80 年代就在中國臺灣、日本等地區和國家甘薯上發生，目前已遍及美洲(美國、秘魯、巴西和阿根廷）、非洲（肯尼亞）、歐洲（西班牙和意大利）和亞洲（日本、韓國、中國和印度）［23-25］。在我國，SPLCV 已在遼寧、廣東和福建的甘薯、江蘇的圓葉矮牽牛、云南的銳葉牽牛和湖南的牽牛花等植物上分離鑒定到SPLCV［26］。可見SPLCV 地理分布和寄主范圍在不斷擴展。2013 年，Zhang 等從湖北圓葉牽牛上分離鑒定到佐治亞甘薯曲葉病毒（SPLCGV）［27］，該病毒分離物（GenBank 登錄號：KF769447）與河北分離物（GenBank 登錄號：JX448368）的序列相似性較高。而本研究又從圓葉牽牛中分離得到SPLCV，該結果證實，牽牛花可能是多種甘薯病毒的中間寄主，應該引起重視，采取有效的防治措施防范甘薯病毒通過圓葉牽牛進一步擴散蔓延。

4 結論

本研究利用雙生病毒簡并引物證實湖北荊州表現黃脈癥狀的圓葉牽牛受到雙生病毒侵染，通過分段克隆獲得病毒分離物的全基因序列，在GenBank 中進行Blast 分析證實該病毒分離物為甘薯曲葉病毒的一個分離物，命名為SPLCV-HB；遺傳進化分析發現，甘薯曲葉病毒湖北分離物與甘薯曲葉病毒湖南分離物處于同一分支，說明兩者具有較近的親緣關系。甘薯曲葉病毒主要通過煙粉虱和種苗帶毒進行傳播與擴散，而本研究的病毒分離物可能來自于湖南。本研究是甘薯曲葉病毒在湖北的首次報道，今后應加強對該類病毒監測。