基于網絡藥理學和分子對接研究牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的作用機制

張 濤， 馬書杰， 葉 斌， 嚴雋陶*

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437；2.上海市第二康復醫院，上海 201900；3.上海市第三康復醫院，上海 200070)

膝骨關節炎是以膝關節周圍關節軟骨退變和繼發性骨反應為特征的關節疾病，在60歲以上的老年人中致殘率超過20%[1]，不僅會影響患者的身心健康，還增加了醫療系統和社會的經濟成本[2]。目前，臨床常用的短期對癥治療藥物主要為非甾體類抗炎藥，但其心血管風險、上消化道刺激、出血等不良反應明顯[3]。研究證實，中醫藥在膝骨關節炎的防治中具有較好的療效，而且不良反應相對較少，臨床應用廣泛[4]。

中醫理論中將膝骨關節炎歸屬為“骨痹”“膝痹”范疇，其發病多因年老體衰、肝腎虧虛而致筋骨失于濡養，或因風寒濕熱之邪流注肌肉、筋骨、關節而致經絡痹阻，氣血運行不暢，肢體筋脈拘急而發病。牛膝與杜仲皆入肝、腎經，均可補肝腎、強筋骨，前者還可逐瘀通經，后者還能祛除關節濕邪，二藥合用可補益肝腎以治本，化瘀化濕以治標。現代研究也顯示，牛膝-杜仲藥對是膝骨關節炎治療中使用頻率最高的藥對之一[5]，但迄今為止尚無該藥對治療膝骨關節炎的相關機制考察。因此，本研究采用網絡藥理學預測牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的潛在作用靶點和信號通路，并結合分子對接技術進行驗證，以期系統全面地揭示藥物與疾病間的關系，并為相關臨床應用和機制研究提供新的證據和思路。

1 材料和方法

1.1 數據庫、軟件及分析平臺 詳見表1。

1.2 活性成分及其作用靶點篩選 使用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(TCMSP)篩選牛膝-杜仲藥對活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug like，DL)≥0.18為篩選條件，將篩選出的活性成分與其潛在作用靶點進行配對，通過Uniprot數據庫轉換出作用靶點的通用基因名稱，未被轉換的靶點使用手動檢索，最后去除重復基因，即為活性成分作用靶點。

表1 數據庫、軟件及分析平臺

1.3 膝骨關節炎疾病靶點預測 以“knee osteoarthritis”為搜索詞，在GeneCard、OMIM數據庫中搜索人類膝骨關節炎的相關基因，合并去除重復項后獲得膝骨關節炎相關靶點。

1.4 藥物-疾病交集靶點基因數據庫構建 使用在線BMK Cloud平臺，將牛膝-杜仲藥對藥物活性成分作用基因與膝骨關節炎基因取交集，并繪制交集基因的維恩圖。

1.5 藥物-疾病交集靶點蛋白互作網絡構建 在STRING數據庫中進行交集靶點的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡分析，使用Cytoscape中的“Network analyzer”插件，通過拓撲學分析計算出PPI網絡各靶點節點的度值(Degree)，根據節點度值大小選定網絡中關鍵靶點基因，度值越大，該基因在PPI網絡中的作用越大。

1.6 GO、KEGG富集分析 利用DAVID數據庫對核心靶點進行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析，探尋牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的生物功能。通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，探究牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的主要信號通路，P<0.05表示差異具有統計學意義。

1.7 “藥物-活性成分-靶點-通路”拓撲網絡構建 使用Cytoscape 3.7.2軟件構建牛膝-杜仲藥對與膝骨關節炎交集靶點的“藥物-活性成分-靶點-通路”調控網絡，“Network analyzer”插件進行網絡拓撲參數分析得出上述網絡中節點的度值，根據度值大小確定重要活性成分和靶點。

1.8 活性成分與靶點蛋白的分子對接驗證 從PDB數據庫下載關鍵靶點蛋白3D結構，從TCMSP平臺下載主要活性成分mol2文件，然后使用PyMOL軟件對關鍵靶點蛋白進行去水、加氫等操作，通過AutoDockTools 1.5.6、AutoDock Vina軟件進行分子對接，記錄結合能。

2 結果

2.1 活性成分及作用靶點 牛膝-杜仲藥對活性成分共323種，其中牛膝176種，杜仲147種，按照口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進行篩選后，最終確定牛膝活性成分17種，杜仲活性成分21種，見表2。同時，篩選出牛膝-杜仲藥對作用靶點共234個。

2.2 膝骨關節炎疾病靶點預測 合并GeneCards、OMIM數據庫中有關膝骨關節炎的基因，去除重復項，獲得疾病相關基因靶點3 090個。

2.3 藥物-疾病交集靶點基因數據庫構建 使用在線BMK Cloud平臺，獲得牛膝-杜仲藥對與膝骨關節炎的藥物-疾病交集靶基因共132個，見圖1。

2.4 藥物-疾病交集靶點蛋白互作網絡構建 通過STRING數據庫將132個交集靶點以最低要求互動得分0.7為篩選參數分析，最終得出778條邊和132個節點。采用Cytoscape軟件構建“活性成分-靶點”蛋白互作網絡，Network Analyzer工具分析網絡中節點的度值，節點大小和顏色深淺反映度值大小，根據其排序確定核心靶點(圖2)，度值排名前10的蛋白見表3，可知這些靶點在PPI網絡中起著關鍵的作用，即為牛膝-杜仲藥對有效成分調控膝骨關節炎的關鍵靶點。

2.5 GO、KEGG富集分析 將132個交集靶點基因上傳到DAVID在線數據庫進行GO富集分析，得到具有統計學意義(P<0.05)的GO條目共749條，其中生物學進程(biological process，BP)585條，細胞組分(cellular component，CC)62條，分子功能(molecular function，MF)102條，靶點基因主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、對缺氧的反應、炎癥反應、對細胞增殖、凋亡的調控等生物學進程等；主要在細胞外基質、線粒體、核漿、胞質等細胞組分處發揮作用，參與的分子功能主要包括蛋白、蛋白激酶、以及轉錄因子的結合等。圖3展示了每個模塊P值最小的前10個條目，其值越小，顏色越偏向紅色，反之則偏向藍色；點的大小表示富集的基因數。KEGG分析顯示，靶點基因富集了108條相關通路，圖4列出了P值排序最小的20個條目。另外，靶點基因主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡以及Nod樣受體通路等，與細胞的凋亡、增殖、分化、轉化以及氧化應激、炎癥反應等密切相關。

表2 牛膝-杜仲活性成分

2.6 藥物-活性成分-靶點-通路調控網絡構建 圖5(顏色越深，度值越大)顯示，度值排名前5位的化合物分別是MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000173(漢黃芩素)、MOL002714(黃芩素)、MOL002773(β-胡蘿卜素)。

2.7 活性成分與靶點蛋白的分子對接 選擇疾病-活性成分-靶點-通路調控網絡及PPI網絡分析結果度值排名前5的活性成分，與靶點基因進行分子對接驗證，使用AutoDock軟件進行結合能力預測，構象越穩定，結合能越低，通常結合能<0 kcal/mol提示分子之間具有結合活性，<-5.0 kcal/mol提示分子之間具有較強的結合活性[6]。將5種活性成分與5個靶蛋白對接后，發現槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素與AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF均有較好的結合能力，見表4。再采用PyMOL軟件對靶點蛋白與成分對接的最佳構象進行可視化分析，直觀展示其構象關系，以槲皮素為例，見圖6。

表3 藥物-疾病核心靶點基因

表4 藥物-疾病核心靶點基因

3 討論

本研究采用網絡藥理學探究了牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的現代分子生物學以及藥理學機制。結果顯示，牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的潛在靶點共132個，核心靶點包括IL6、TP53、AKT1、VEGFA、MMP9等，并可能通過參與氧化應激反應、炎癥反應、對細胞增殖、凋亡的調控等生物學進程，影響蛋白、酶、轉錄因子的結合等分子功能[7]。TP53便具有抑制DNA復制，阻斷細胞周期，導致細胞凋亡，加速軟骨降解的作用[8]，細胞實驗證實牛膝提取物可以在體外抑制大鼠變性軟骨細胞中p53的表達[9]。AKT1是PI3K信號通路中重要的下游靶點激酶，其參與的PI3K/AKT信號通路是抗軟骨細胞凋亡的重要通路[10]。研究證實促炎因子IL-6在膝骨關節炎患者的關節液、滑膜，軟骨下骨和軟骨中表達升高。IL-6還可引起基質金屬蛋白酶MMP9表達的升高，抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成，加速細胞外基質的降解，并可通過激活破骨細胞在骨吸收中起關鍵作用[11]。VEGFA同樣參與了膝骨關節炎軟骨退變和骨贅形成等病理反應[12]，研究顯示VEGFA可刺激血管內皮細胞分裂進而促進血管的新生，加速膝關節的營養物質的交換以及炎性產物的代謝[13]，促進軟骨滑膜細胞的修復，此外VEGFA具有加速骨形成同時抑制骨吸收的作用[14]。

本研究顯示，牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的有效成分主要為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素以及β-胡蘿卜素等，這些小分子成分大多具有抗氧化、抗炎以及軟骨保護作用。槲皮素是一種具有抗炎、抗氧化作用的多酚類生物黃酮，研究表明其可清除活性氧自由基，改善機體的氧化應激[15]，緩解膝骨關節炎的臨床癥狀，并可減緩大鼠關節炎的發展速度[16]，亦可抑制基質降解蛋白酶和炎性介質的表達，同時促進軟骨合成代謝因子的產生，減輕膝關節軟骨的降解以及軟骨細胞的凋亡[17]，而黃芩素、山柰酚與槲皮素作用相似[18]。漢黃芩素已被證實可通過抑制炎性介質如IL6、COX-2等的表達，并降低基質金屬蛋白酶如MMP-13、MMP9等的表達，發揮其抗炎及軟骨保護作用[19]。β-胡蘿卜素可用于治療多種因衰老引起的退行性病變，已被證實可通過抑制NF-κB信號通路抑制炎性因子的表達[20]。

牛膝-杜仲藥對在治療膝骨關節炎的靶點蛋白涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、Toll樣受體信號通路等，與軟骨細胞的凋亡、分化及氧化應激、炎癥反應、骨的重塑與吸收等密切相關。TNF-α可與膜受體結合，激活轉錄因子NF-κB和MAPK信號通路，增強炎癥反應進而誘導基質金屬蛋白酶產生，并誘導IL6等炎癥因子產生，加劇軟骨的破壞[21]。HIF-1是維持軟骨細胞穩態和支持細胞分化的重要因素[22]，研究表明HIF-1α可通過抑制β-catenin轉錄活性下調軟骨細胞中MMP13的表達，從而延緩骨關節炎的疾病進展，缺乏HIF-1α則可加速軟骨的分解代謝[23]。Toll樣受體(TLR)是跨膜信號轉導受體，研究顯示，TLRs在膝骨關節炎軟骨細胞中表達上調[24]，TLR1-7和TLR9在關節炎患者的滑膜中上調，而TLR4與關節炎的嚴重程度有關[25]，TLR2/TLR4信號通路誘導IL-1和MMPs表達，增加NO和PGE2的產生，加速蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的降解，導致關節軟骨破壞，并促進膝骨關節炎的形成[26-27]。作為骨關節炎的重要治療靶點，破骨細胞可參與骨吸收以維持骨重塑的動態平衡[28]，已有研究證實骨關節炎的形成與趨化因子誘導的破骨細胞分化異常有關[29]。分子對接顯示，牛膝-杜仲藥對關鍵活性成分與關鍵靶點蛋白結合時的結合能均小于0 kcal/mol，提示其結合活性較好，證實了牛膝-杜仲藥對治療膝骨關節炎的靶向作用。

綜上所述，牛膝-杜仲藥對在膝骨關節炎的治療中可能涉及不同靶點和通路，并在調控細胞凋亡、軟骨基質降解、炎癥反應以及骨重塑中發揮治療作用，延緩膝骨關節炎的進展，體現了中醫藥治療膝骨關節炎多靶點、多途徑的特點。