液相色譜—串聯質譜測定水產品中15種苯二氮卓類鎮靜劑的藥物殘留

張秋云 楊洪生,2 譚秀慧 朱曉華,2 陳風蔚 陳慧敏

(1. 江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017；2. 江蘇省水產質量檢測中心，江蘇 南京 210017；3. 上海愛博才思分析儀器貿易有限公司，上海 200335)

苯二氮卓類鎮靜劑是1,4-苯并二氮卓類衍生物，為苯二氮卓受體激動劑，可引起中樞神經系統不同部位的抑制[1-3]。長期服用此類藥物會產生耐藥性及成癮性，突然停藥還會導致戒斷癥狀出現[4-5]。苯二氮卓類鎮靜劑具有蓄積毒性，在體內吸收快，排泄慢，長期攝入后，會加重肝臟負擔，導致肝功能下降，對中樞神經系統造成不良影響，引起頭腦昏沉，記憶退化、運動障礙等問題[6-9]。中國于2002年禁止在飼料和動物飲用水中使用硝西泮、奧沙西泮等藥物[10]。最新發布的GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規定，地西泮僅允許治療使用，但不得檢出。

目前，檢測鎮定劑類藥物殘留的主要方法有酶聯免疫法(ELISA)[11]、液相色譜法(LC)[12-13]、氣相色譜—質譜聯用法(GC-MS)[14-15]、液相色譜—串聯質譜法(LC-MS/MS)[16-18]，其中氣相色譜—質譜聯用法、酶聯免疫法和液相色譜法前處理過程復雜，耗時長，穩定性和重復性差，靈敏度低，難以滿足日常檢測需求，而液相色譜—串聯質譜法具有靈敏度高，抗干擾性強，重現性好等特點，是目前檢測鎮靜劑類藥物最主要的檢測方法。此外，內標法相對于外標法具有簡化前處理過程，有效抵消基質效應等優點，是質譜法的最優選擇[19]。目前，水產品中檢測常用鎮靜劑類藥物定量定性檢測主要以外標法為主，如何曉明等[20]建立了水產品中13種鎮靜劑殘留檢測的液質聯用法，采用外標法定量，其前處理過程采用QuEChERS凈化，但操作較繁瑣、凈化效果較差，也未考慮基質效應可能對結果準確性的影響。有學者采用內標法，但是也僅僅用1～3種內標物，如張璇等[18]建立了液質聯用法測定水產品中12種鎮靜劑及其代謝物殘留的內標法，但只用了安眠酮-D7、鹽酸氯丙嗪-D6、地西泮-D53種內標，具有一定的局限性。

研究擬建立一種以內標法為基礎且能同時檢測多種鎮靜劑類物質及其代謝物的方法，并對樣品前處理方法和儀器分析條件進行改進和優化，以期解決基質干擾問題，為水產品中鎮靜劑殘留監測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15種鎮靜劑及14種同位素內標標準儲備液(具體名稱見表1)：質量濃度均為1.0 mg/mL，美國Cerilliant公司；

乙腈、甲醇、氨水、乙酸乙酯和甲酸：色譜純，德國Merck公司；

Waters Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(150 mg/3 mL)、Waters Oasis HLB固相萃取小柱(150 mg/3 mL)、Waters C18柱(200 mg/3 mL)、Waters CORTECS C18液相色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)：美國Waters公司；

Supelclean LC-18 固相萃取儀：德國Merck公司；

草魚、南美白對蝦和中華絨螯蟹等水產品：市售。

1.2 儀器與設備

三重四極桿液質聯用儀：SCIEX Triple QuadTM5500型，美國Sciex公司；

高速冷凍離心機：Avanti J-26XP型，美國Beckman Coulter公司；

電子天平：CP225D型，德國Sartorius公司；

全自動濃縮儀：Turbo Vap LV型，瑞典Biotage公司；

純水儀：Milli-Q型，美國Millipore公司。

1.3 標準溶液配制

(1) 混合標準工作液：分別移取一定體積的15種鎮定劑標準儲備液用乙腈配制成質量濃度均為100 μg/L的混合標準溶液，-18 ℃保存。

(2) 混合內標標準工作液：分別移取一定體積的同位素內標儲備液用乙腈配制成質量濃度均為50 μg/L的混合標準溶液，-18 ℃保存。

1.4 樣品前處理

草魚、南美白對蝦和中華絨螯蟹分別取可食部分，充分均質后-20 ℃保存。

于50 mL聚丙烯離心管中準確稱取試樣2.00 g，添加質量濃度為50 μg/L混合內標標準溶液200 μL，靜置5 min，加入提取溶劑乙腈10 mL，渦旋混勻30 s，于常溫下超聲10 min，然后8 000 r/min離心10 min。準確移取5 mL上清液過Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱，調節流速至小于1滴/s，收集流出液于10 mL刻度離心管中，真空抽干1 min。流出液于50 ℃氮氣吹至0.5 mL左右，用乙腈定容至1 mL，過0.22 μm尼龍微孔濾膜，備用待測。

1.5 分析方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS C18液相色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量1 μL；流速：400 μL/min；流動相A：0.1%甲酸水溶液；B：甲醇。梯度洗脫程序：0～8.00 min，95% A；8.00～12.00 min，95%～10% A；12.00～12.10 min，10%～95% A；12.10～15.00 min，95% A。

1.5.2 質譜條件 離子源：ESI源，正離子模式；監測方式：多反應監測模式(MRM)；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：450 ℃；氣簾氣：0.24 MPa；霧化氣：0.38 MPa；輔助霧化氣：0.38 MPa。15種鎮靜劑和14種內標物的監測離子對、去簇電壓及碰撞能量等質譜參數見表1(其中普拉西泮對應內標為勞拉西泮-D4)。

表1 15種鎮靜劑和14種內標物的監測離子對、去簇電壓及碰撞能量?

1.6 數據處理

采用Origin軟件對試驗數據進行處理，分析檢出限、定量限、準確度、精密度及回收率。

2 結果與討論

2.1 液質條件優化

試驗所選的鎮靜劑均含有仲胺或者叔胺基團，屬于苯二氮卓類藥物，易與氫離子結合成帶正電荷的準分子離子[M+H]+，因此在正離子模式下，采用流動注射的方式分別將質量濃度為1 μg/mL的地西泮等15種鎮定劑及14種內標物注入質譜，對目標化合物在m/z為200～450的范圍內進行一級質譜全掃描，獲得分子離子峰[M+H]+，且強度穩定在1×106以上。以高純氮氣為碰撞氣，通過優化碰撞能量和去簇電壓等質譜參數，分別選取干擾少、響應值高的2個子離子作為定量離子和定性離子，其中內標化合物只選取1個離子，用于目標化合物的定量。同時，分別考察了0.1%甲酸水溶液—乙腈、0.1%甲酸水溶液—甲醇、5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)—甲醇、5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)—乙腈4種流動相對目標化合物的靈敏度和峰型的影響。經過比較，采用0.1%甲酸水溶液—甲醇為流動相時，目標化合物的質譜響應值高，峰型更尖銳，各物質間的分離效果更好，因此選用0.1%甲酸水溶液—甲醇作為目標化合物檢測的流動相，在此條件下15種鎮靜劑及14種內標化合物的提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 15種鎮靜劑及14種內標化合物的提取離子流色譜圖Figure 1 Extracted ion chromatograms of the 15 kinds of sedatives and 14 kinds of isotope internal standards

2.2 樣品提取劑選擇

地西泮等15種鎮定劑為脂溶性物質，常用的提取劑有乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑[21-25]。研究比較了乙腈、1%甲酸—乙腈、1%氨水—乙腈、1%氨水—乙酸乙酯、1%甲酸—乙酸乙酯、乙酸乙酯6種提取劑對目標化合物提取效果的影響。由于1%氨水—乙酸乙酯、1%甲酸—乙酸乙酯為提取溶劑時，提取液較為混濁且出現不同程度的乳化現象，分離效果差，因此在試驗前期予以排除。其他4種提取劑的試驗結果(如圖2)表明，乙酸乙酯相對乙腈系列的提取溶劑來說，其總體回收率偏低，尤其是2′-氯地西泮和2-羥乙基氟拉西泮，其回收率僅為55.8%和60.1%；1%氨水—乙腈、1%甲酸—乙腈和乙腈作為提取溶劑時目標化合物的提取效果相差不大，考慮到地西泮等15種鎮靜劑的極性較弱，易溶于甲醇、乙腈等試劑，不易溶于水，而乙腈相對操作簡便，因此選擇乙腈作為目標化合物的提取劑。

2.3 濃縮過程優化

藥物殘留分析過程中常用的濃縮方法有旋轉蒸發、氮吹、真空濃縮、冷凍干燥等，而氮吹由于干燥速度快、處理樣品個數多、操作簡單等優點而被廣泛應用[26-27]。研究以15種鎮靜劑標準溶液為對象，考察了不同溫度下(35，40，50，60 ℃)氮吹對回收率的影響。由圖3可知，在不同的溫度進行氮吹，目標化合物的響應值有所差異，溫度越高耗時越短。35 ℃時氯安定和氯硝西泮的回收率低于70%，60 ℃時溫度過高，氯硝西泮和去甲基氯硝西泮回收率低于70%，而且各目標物的回收率比40 ℃ 和50 ℃ 的顯著降低，而在40 ℃和50 ℃下氮吹各目標物的回收率均達到70%～120%，由于在40 ℃下氮吹耗時較50 ℃下的長，因此，選擇50 ℃為適宜氮吹溫度。

1. 地西泮 2. 硝西泮 3. 氯安定 4. 奧沙西泮 5. 氟拉西泮 6. 氟硝西泮 7. 氯甲西泮 8. 勞拉西泮 9. 普拉西泮 10. 替馬西泮 11. 7-氨基氟硝西泮 12. 去甲西泮 13. 去甲基氟硝西泮 14. 2-羥乙基氟拉西泮 15. 2′-氯地西泮 以草魚為基質，加標水平10 μg/kg

2.4 凈化方法選擇

研究考察了Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱、Waters Oasis HLB固相萃取柱和Waters C18固相萃取柱對鎮定劑的凈化效果。結果(圖4)表明，Waters C18固相萃取柱凈化效果較差，勞拉西泮、奧沙西泮、2′-氯地西泮等目標化合物在Waters C18固相萃取柱凈化后回收率低于60%；Waters Oasis HLB固相萃取柱和Waters Oasis PRIME HLB柱對目標化合物的凈化效果無顯著差異，但Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱與傳統的Waters Oasis HLB固相萃取柱相比，省去了活化、平衡步驟，樣品提取液直接過柱，簡化了前處理過程，同時又能有效去除95%以上的脂肪、磷脂等基質干擾物，樣品更加干凈，基質效應更小，因此選擇Waters Oasis PRIME HLB為凈化小柱。

2.5 基質效應

由于同位素內標和待測化學物質的性質相似，因此采用同位素稀釋方法，能夠有效抵消基質效應。根據式(1)計算不同基質中15種鎮靜劑的基質效應(ME)[28]。

(1)

式中：

ME——基質效應，%；

K1——基質匹配標準曲線的斜率；

K2——溶劑標準曲線的斜率。

ME值為80%～120%，表示基質效應較弱，即目標化合物在純溶劑與基質溶液中的信號強度差別不大；ME值<80%，表示有較強的基質抑制效應，使得目標化合物信號顯著減弱；ME值>120%，表示有較強的基質增強效應，使得目標化合物信號顯著增強。

如圖5所示，在草魚、南美白對蝦和中華絨螯蟹3種不同的基質中15種鎮靜劑均存在不同程度的基質效應。地西泮、硝西泮、氯甲西泮等鎮靜劑在草魚、南美白對蝦和中華絨螯蟹中基質抑制效應較大，而奧沙西泮鎮靜劑在中華絨螯蟹基質中有明顯基質增強效應。因此，為有效降低基質效應，采用基質標準工作液中添加內標的方法來進行定量分析，以確保結果的準確性。

1. 地西泮 2. 硝西泮 3. 氯安定 4. 奧沙西泮 5. 氟拉西泮 6. 氟硝西泮 7. 氯甲西泮 8. 勞拉西泮 9. 普拉西泮 10. 替馬西泮 11. 7-氨基氟硝西泮 12. 去甲西泮 13. 去甲基氟硝西泮 14. 2-羥乙基氟拉西泮 15. 2′-氯地西泮

2.6 方法的線性范圍和檢出限

在草魚空白基質液中添加不同濃度的混合標準工作溶液，按1.4和1.5的條件進行測定。以各目標物質量濃度為橫坐標(X)，目標化合物峰面積和對應內標的峰面積比值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。由表2可知，15種鎮定劑在質量濃度為1～100 ng/mL的范圍內呈良好的線性關系，相關系數(R)均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)作為方法的檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)作為方法定量限(LOQ)。

2.7 方法準確度和精密度

在2.00 g空白樣品中添加質量濃度為50 μg/mL混合內標標準溶液200 μL，質量濃度為100 μg/L的15種鎮定劑的混合標準溶液100，200，500 μL，即添加水平為5，10，25 μg/kg，每個添加水平平行測定6次，其加標回收率為78%～125%，RSD為1.52%～12.02%，見表3。表明該方法具有良好的準確度和精密度。

2.8 實際樣品檢測

利用上述檢測方法對市場上常見的20份不同類型水產品(草魚、鯽魚、南美白對蝦、中華絨螯蟹等)進行檢測，結果顯示，在1份草魚樣品中檢出地西泮含量為0.85 μg/kg，其余樣品中均未檢出苯二氮卓類鎮靜劑。

表2 15種鎮靜劑的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

表3 15種鎮靜劑的準確度和精密度

3 結論

研究建立了液相色譜—串聯質譜法測定水產品中15種苯二氮卓類鎮定劑的分析方法，對提取溶劑、凈化條件、濃縮方式、基質效應等因素進行了優化，采用同位素稀釋，有效抑制基質效應干擾，提高了試驗準確性。該方法操作簡單、經濟、高效，方法的準確度、精密度及靈敏度均能滿足日常檢測要求，適用于實驗室大批量水產品樣品的快速測定。