李鵬川 梁艷 張林西 吳雪瓊

迄今為止，卡介苗是世界上唯一獲得許可的結核病疫苗，但它對結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人群不能產生有效的預防和保護作用[1]。因此，研究針對LTBI人群的疫苗對于結核病的控制十分重要。目前國內外新型結核病疫苗的種類主要有滅活疫苗、活疫苗和亞單位疫苗。亞單位疫苗只用結核分枝桿菌(Mycombacteriumtuberculosis, MTB)的一部分成份引起機體產生免疫保護反應，主要包括DNA疫苗、重組蛋白疫苗或多肽疫苗(加佐劑)、多肽以外的其他純化的主要成份(如枝菌酸、糖脂，等)，可作為卡介苗的加強疫苗。

W541是由MTB增殖期抗原Ag85A和Ag85B及潛伏相關抗原Rv3407和Rv1733c四種抗原串聯起來的新型多抗原表位融合DNA疫苗編碼的蛋白。Ag85復合物是MTB和卡介苗的主要分泌性蛋白，在H37Rv標準株中占分泌蛋白總量的30%，是一組重要的分枝桿菌分泌蛋白。Ag85復合物是由Ag85A、Ag85B和Ag85C 3個蛋白組成。有研究表明，Ag85A和Ag85B可誘導較強的輔助性T淋巴細胞1型(Th1型)免疫反應，誘導γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)升高，而Ag85C卻無此效應。有研究發現，Rv3407是存在于H37Rv菌株全細胞裂解液中的1個LTBI激活相關的蛋白；對Rv3407蛋白抗原表位進行預測，發現它是1個T細胞和B細胞抗原表位都較豐富的蛋白抗原[2]；Rv3407 DNA疫苗可明顯誘導小鼠體液和Th1型細胞免疫應答，對小鼠結核模型具有明顯的免疫治療作用[3]。Rv1733c是MTB在休眠期表達量比較高的一種保守的跨膜蛋白。Black等[4]在南非、岡比亞和烏干達等3個結核病高負擔國家中研究了7個經典的MTB重組蛋白抗原和51個休眠調節子編碼的MTB重組蛋白抗原刺激人機體產生的免疫應答情況，發現Rv1733c抗原是被識別頻率最高的一個潛伏相關蛋白抗原，并且應用酶聯免疫吸附試驗檢測全血中分泌的IFN-γ量也較高；Rv1733c DNA疫苗對小鼠結核模型有一定的治療作用[5]。因此，筆者選擇這4種蛋白的抗原表位串聯構建重組蛋白和DNA疫苗，應用生物信息學方法對MTB W541蛋白的結構及功能進行預測分析，為研究新型結核病疫苗提供理論依據。

材料和方法

一、W541蛋白的氨基酸序列

本實驗室構建的多表位串聯DNA疫苗編碼蛋白W541的氨基酸序列為：FSRPGLPVEYLQVP

SPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQD

DFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSF

YSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWL

QANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHP

QQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDA

GGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIA

NNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFV

RTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSW

EYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQG

AGSGGGSGGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGG

AATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQF

QSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPA

FEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGK

AGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGS

AAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSAL

LDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPS

SDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNG

TPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNA

AGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKG

DLQGPGPGLRQHASRYLARVEAGGPGPGSGV

LIPARRPQNLLDVTAEPARGRKRTLSDVLNEM

RGPGPGIPFAAAAGTAVQDSRSHVYAHQAQT

RHP。

二、W541蛋白的序列分析

分別應用在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/Protparam)預測分析蛋白的理化性質；應用Protscale(https://web.expasy.org/protscale)預測分析蛋白的親(疏)水性；應用TMHMM(TMHMM Server v.2.0)(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預測分析蛋白的跨膜區域。

三、W541蛋白的二級和三級結構預測

應用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對該蛋白的二級結構進行預測分析；應用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)分析其三級結構，并進行同源建模。

四、W541蛋白質亞細胞定位預測

應用PSORT Prediction (https://psort.hgc.jp/)和SingnalP 5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預測分析W541蛋白的亞細胞定位及信號肽。

五、W541蛋白質翻譯后的修飾預測

應用NetNGlyc 1.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)和NetOGlyc 4.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)預測蛋白的糖基化修飾位點；應用NetPhos 3.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預測蛋白的磷酸化位點。

六、W541蛋白抗原表位的預測

1．B細胞表位的預測：應用在線軟件IEDB(http://tools.iedb.org/bcell/)對該蛋白的B細胞抗原表位進行預測。輸入氨基酸序列，通過KarpIus&Schulz分析柔韌性、Kolaskar和Tongaonkar預測抗原性、Emini預測抗原表面可及性、Parker預測親水性，Chou和Fasman法預測氨基酸編碼蛋白質的β轉角，對B細胞表位進行聯合預測分析；最后選取親水性與表面可及性良好、柔韌性強、抗原性好、最好為卷曲和轉角這種可能性大的區域作為候選B細胞表位，盡量避開a螺旋、β折疊結構。

2．Th表位的預測：(1)應用SYFPEITHI超基序法預測Th表位，登陸網址(http://www.syfpeithi.de/)，點擊EPITOPEPREDICTION進入表位預測界面，輸入W541蛋白氨基酸序列，對MHC類型為HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301(DR17)、HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501(DR2b)進行遠程預測，選多肽長度為15aa，取分值≥18分的序列為候選Th表位。(2)應用RANKPEP軟件預測Th表位，登陸網址(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，輸入W541蛋白氨基酸序列，在MHCII中選擇亞型為HLA-DR1(DRB1*0101)、HLA-DR17(DRB1*0301)、HLA-DR4(DRB1*0401)、HLA-DR7(DRB1*0701)、HLA-DR8(DRB1*0801)、HLA-DR11(DRB1*1101)及HLA-DR15(DRB1*1501)的限制性Th細胞表位進行預測，記錄有紅色標記的為候選表位序列。綜合分析上述兩種軟件的預測結果，將得分均較高的序列選為候選Th表位。

3.CTL表位的預測：(1)應用SYFPEITHI超基序法預測CTL表位，登陸網址(http://www.syfpeithi.de/)，點擊EPITOPEPREDICTION進入表位預測界面，輸入W541蛋白氨基酸序列，選擇HLA-A*02:01、HLA-A*03、HLA-B*07:02三類進行遠程預測，選多肽長度為9aa，取分值≥18分的序列。(2)應用RANKPEP軟件預測CTL表位，登陸網址(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，輸入W541蛋白氨基酸序列，在MHCI中選擇HLA-A*02:01(A2)、HLA-A*03:01(A3)、HLA-B*07:02 (B7)三類限制表型進行遠程預測，記錄有紅色標記的為候選表位序列。(3)應用NetMHC軟件預測CTL表位，登陸網址(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)，輸入W541蛋白氨基酸序列，選多肽長度為9aa，對MHC Ⅰ類型為HLA-A*02:01(A2)、HLA-A*03:01(A3)、HLA-B*07:02(B7)三類進行遠程預測,記錄有紅色標記的為候選表位序列。(4)應用NetCTL軟件預測CTL表位，登陸網址(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，輸入W541 DNA疫苗氨基酸序列，選擇A2、A3、B7三類表型，記錄綜合預測值(COMB)≥0.75的9肽為候選CTL表位。(5)應用IEDB軟件預測CTL表位，登陸網址(http://www.iedb.org/)，輸入W541蛋白氨基酸序列，選多肽長度為9aa，對MHC Ⅰ類型為HLA-A*02:01(A2)、HLA-A*03:01(A3)、HLA-B*07:02(B7)三類進行遠程預測,記錄得分>0.5分的為候選表位序列。綜合分析上述5種軟件的預測結果，將得分均較高的序列選為候選CTL表位。

七、W541蛋白相互作用網絡分析

應用STRING在線軟件(https://www.string-db.org/)預測蛋白相互作用網絡。

八、W541蛋白與人類蛋白的同源性分析

采用EXPASY在線軟件(https://web.expasy.org/blast/)BLAST分析蛋白氨基酸序列與人類蛋白的同源性。

結 果

一、W541的序列分析

1. W541蛋白的理化性質分析：分子式為C3329H5035N923O993S24，原子總數為10 304個，由C、H、N、O、S 5種元素組成，相對分子質量為74.64463，理論等電點為6.29。共由704個氨基酸構成(圖1)，該蛋白中帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數為48，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數為52。計算出不穩定指數為45.37，而將該蛋白質歸類為不穩定蛋白質。脂溶性指數為68.85，消光系數為152 095或151 720。親水性總平均值(GRAVY)為-0.294，屬于親水性蛋白質(圖2)。

圖1 MTB W541氨基酸的種類、數目及比例

圖2 MTB W541蛋白的親(疏)水性

2．應用TMHMM軟件預測跨膜結構：結果顯示該蛋白跨膜螺旋氨基酸數為7.8724(該指標>18提示很有可能為跨膜蛋白)，N端前60個氨基酸中跨膜氨基酸數為0.0007，N端位于膜胞質側的總概率為0.05535。綜合分析表明W541蛋白位于膜外，沒有跨膜結構(圖3)。

注 橫坐標代表蛋白氨基酸殘基序號，縱坐標的數值代表每個氨基酸位于膜內側、膜外側或跨膜螺旋區的概率值

二、W541的二級和三級結構分析

應用SOPMA軟件預測W541蛋白的二級結構結果見圖4。該蛋白二級結構中含α-螺旋(Hh)190個(占26.99%)，β-折疊(Ee)134個(占19.03%)，β-轉角(Tt)81個(占11.51%)，無規則卷曲(Cc)299個(占42.47%)。W541蛋白中α-螺旋、β-折疊和β-轉角的總含量為 57.53%，提示該蛋白的二級結構可能較穩定。

圖4 MTB W541蛋白的二級結構預測

應用SWISS-MODEL服務器總共構建出3個W541蛋白三級結構模型圖，本文選擇模型1(圖5A)，其序列與MTB Ag85C蛋白的一致性為67.01%，可信度范圍為0.32，待測蛋白與膜蛋白的匹配度區間為-0.82。應用MolProbity(MolProbity version 4.4)對該三級結構模型進行評估(圖5B)，結果顯示90%以上的氨基酸殘基位于可信區域內，Ramachandran異常值為0.72%，只有一個氨基酸殘基SER33A出現C-β偏差而位于白色區域，證明該模型結構較可靠。

注 深綠色代表氨基酸殘基在最大允許區域，中綠色代表氨基酸殘基在允許區域，淺綠色代表氨基酸殘基在一般允許區域，白色為不允許區域。深綠色與中、淺綠色區域一致。(A)MTB W541蛋白同源建模的三級結構圖；(B)建模評價拉曼(Ramachandran)圖

三、 W541蛋白質亞細胞定位注釋

應用SignalP和PSORT軟件分析均顯示該蛋白無信號肽(圖6)。應用PSORT軟件對蛋白質進行亞細胞定位分析，顯示該氨基酸為細菌膜蛋白質。

圖6 MTB W541蛋白的信號肽預測

四、W541蛋白質翻譯后的修飾

1.蛋白磷酸化位點的預測：應用NetPhos 3.1服務器預測出W541蛋白磷酸化位點62個，其中絲氨酸磷酸化位點35個，蘇氨酸磷酸化位點15個，酪氨酸磷酸化位點12個(圖7)。

圖7 MTB W541蛋白的磷酸化位點預測

2.蛋白糖基化位點的預測：應用NetNGlyc 1.0 服務器預測出W541蛋白可能存在2個N型糖基化修飾位點，分別位于203和590(圖8)；應用NetOGlyc 4.0 服務器預測出W541蛋白可能存在4個 O型糖基化修飾位點，分別位于285、288、297和652位點。

圖8 MTB W541糖基化位點預測

五、 W541蛋白的表位預測

1．W541抗原蛋白的B細胞表位預測：通過IEDB軟件對W541蛋白的B細胞表位進行預測，柔韌性越強越有利于抗原與抗體結合，柔韌性參數以基線1.0為參照，高于1.0的氨基酸區段柔韌性強，是易形成抗原表位的區域，可及性高于基線1.0的區段易形成B細胞表位，再通過結合線性表位、β轉角、抗原性這3個方面篩選，篩選得出B細胞表位有4～16、34～42、64～72等23個(表1)。

表1 IEDB軟件預測MTB W541蛋白的B細胞抗原表位

2.W541的Th細胞表位：利用SYFPEITHI和RANKPEP在線軟件預測，分值較高的Th細胞抗原表位結果見表2、3，其中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*1501表型的表位數目較多。結合HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*01101、表型中分值較高的表位、無法預測的HLA-DRB1*0801表型中的表位及兩種預測軟件的結果綜合分析，判定該蛋白的優勢候選Th表位主要集中在94～108、226～240、304～318等氨基酸區段。

表2 MTB W541抗原的Th表位

3.W541的CTL細胞表位：運用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC和IEDB 4種生物信息學軟件對W541進行預測，分值較高的CTL細胞抗原表位結果見表4、5。綜合分析得出該蛋白的CTL表位數量主要集中分布于HLA-A2和HLA-B7限制性T細胞表位，少部分位于HLA-A3限制性T細胞表位，推測其最佳候選CTL表位可能位于MPVGGQSSF(70～78)，AMGDAGGYK(167～175)，KLIANNTRV(199～207)等氨基酸區段。

表3 MTB W541抗原的候選Th表位

續表3

表4 MTB W541蛋白的CTL表位

圖9 MTB W541蛋白相互作用網絡

六、W541蛋白相互作用網絡分析結果

應用STRING服務器對W541蛋白進行蛋白質相互作用網絡分析，結果顯示，W541蛋白的主要組成蛋白fbpA(即Ag85A)和fbpB(即Ag85B)與10個MTB蛋白rpfC(Rv1884)、Rv1885c(即MtCM)、Rv3668c、aftB、lpqH(即Rv3763、19 kDa脂蛋白)、esxB(即Rv3874、CFP10)、esxA(即Rv3875、ESAT6)、hspX(即Rv2031c、16 kDa抗原)、esxH(即Rv0288、TB10.4)和mpt64(即Rv3036c)均存在相互作用關系(圖9)。

七、W541蛋白與人類蛋白同源性分析結果

通過BLAST分析，發現W541蛋白的氨基酸序列與人輸卵管相關蛋白3(tubby-related protein 3)只有3.27%(23/704)的同源性，同源性主要位于第26～92位氨基酸殘基，這段同源性達到33.82%(23/68)。與人S-甲酰谷胱甘肽水解酶也只有2.70%(19/704)的同源性。由此可見，W541蛋白與人類蛋白的同源性極低。

討 論

近年來生物信息學方法的迅猛發展和互聯網數據庫的開發應用，為蛋白優勢表位的選擇和表位串聯疫苗的評估提供了有效的方法。本研究利用生物信息學方法分析MTB W541的結構及功能，為W541疫苗的進一步優化奠定了基礎。

信號肽不僅與蛋白質在細胞內的定位有關，還能決定一個蛋白質是否為分泌蛋白[6]。而跨膜區的蛋白質有可能是膜偶聯受體，也可能是膜偶聯酶及膜離子通道等。本研究預測W541蛋白無信號肽和跨膜區，定位于細胞質膜，提示該蛋白可能為非跨膜、不分泌的細胞質膜蛋白，這與其構成的4種抗原單獨預測并不完全一致，目前研究已證實Ag85A、Ag85B、Rv3407和Rv1733c均未發現信號肽[7-9]，但殷月蘭等[8]的預測顯示Ag85A和Ag85B兩者均含有一個跨膜螺旋結構，并可通過其他分泌途徑釋放到菌體外；而de Souza等[7]在MTB H37Rv標準株的培養濾液和細胞壁中未能檢出Rv3407蛋白；劉靜等[9]報道Rv1733c也是一個跨膜蛋白。由此可見，4種蛋白部分抗原表位串聯后形成的W541融合蛋白的特性已發生了很大變化。

蛋白質磷酸化是一種重要的翻譯后修飾，大多數蛋白質在翻譯結束后需經不同程度的化學修飾才能成為具有功能的成熟蛋白質。在真核生物中，蛋白質磷酸化通常發生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和組氨酸殘基上。本研究發現W541蛋白含有62個磷酸化位點，劉靜等[9]和李小平等[2]預測Rv1733c/Rv3407也分別含有多個磷酸化位點，蛋白質通過這種修飾參與激素、生長因子、細胞因子和環境應激中的信號轉導，誘導多種生理功能，調控細胞過程，從細胞增殖、分化、發育到細胞凋亡等[10]。因此，W541可能具有重要的調控作用。

蛋白質糖基化也是一種重要的翻譯后修飾，使蛋白質在成熟過程中折疊成正確構象，可增加蛋白質的穩定性，而且這些蛋白通常與細胞信號的識別有關，如受體蛋白等。本研究發現，W541蛋白含有6個糖基化位點，也提示它具有調節蛋白質的功能作用，對于W541蛋白作為疫苗的溶解度、穩定性、半衰期和活性等都將具有重要的影響。

蛋白質的二級結構與B細胞表位關系密切。蛋白二級結構中的β-轉角和無規則卷曲結構相對松散，易于扭曲、盤旋，且暴露于蛋白表面，可與抗體較好的嵌合，常含有B細胞的優勢表位[11]。α螺旋和β折疊結構規則不易變形，常處于蛋白質內部，與抗體不易結合，一般不含有B細胞表位。由于W541蛋白含有較多的Ag85A和Ag85B抗原表位，因此本研究W541蛋白的二級結構和三級結構預測的結果與殷月蘭等[8]對Ag85復合物預測的結果相似，都含有較大比例的無規則卷曲，它們大多位于蛋白分子表面，較可能成為優勢B細胞抗原表位，而能夠誘導機體產生有效的免疫應答。本研究結果顯示，W541蛋白具有Th表位、CTL表位和B細胞表位，是一個T細胞抗原表位占優勢的蛋白抗原，其中許多Th表位和CTL表位均已通過試驗證明，如陳燕等[12]研究證實GLPVEYLQV和KLIANNTRV抗原肽是MTB Ag85A中2個主要的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。殷月蘭等[8]、liang等[13]、李小平等[2]、劉靜等[9]的研究結果已顯示W541蛋白的主要構成抗原Ag85A、Ag85B和Rv3407、Rv1733c蛋白均具有誘導細胞免疫應答和體液免疫應答的效能。鄭越[14]也報道Ag85A、Ag85B DNA疫苗都具有較強的免疫原性，呈Th1型細胞介導的免疫應答。T細胞表位誘導的細胞免疫應答在抗結核免疫中發揮關鍵的作用；B細胞誘導的體液免疫應答在抗MTB感染過程中也發揮一定的免疫保護作用，如通過抗體的中和作用、調理吞噬作用、激活補體作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用等，減少病理損傷，增強對MTB的殺傷作用。因此，W541蛋白可能成為理想的免疫原，為疫苗的研發奠定基礎。

本研究對W541蛋白相互作用網絡分析發現，W541的主要組成蛋白Ag85A和Ag85B之間不存在相互作用關系；與其存在相互作用關系的10個MTB蛋白中，大多數是分泌蛋白，而且文獻報道中許多蛋白為T細胞抗原，如早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)和培養濾液蛋白-10(CFP-10)因能誘導宿主產生強烈細胞免疫應答，成為新型結核病疫苗的熱門優勢抗原[15]。袁偉[16]將MTB休眠期抗原HspX與Ag85B和ESAT-6聯合構建了能夠在真核細胞表達融合蛋白的重組質粒pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX，發現DNA疫苗可在小鼠體內刺激產生較強的體液和細胞免疫應答，具有較強的免疫原性。TB10.4含有CD8 T細胞表位，在整個MTB感染過程中均可誘導特異性CD8 T細胞應答，可招募特異性CD8 T細胞到感染部位并表達CD44、TNF-α和IFN-γ，上調CD8 T細胞的FasL和LAMP-1/2(CD107A/B)的表達水平，使這兩種細胞具有強烈的體內細胞溶解活性[17]。MTB MPT64 DNA疫苗免疫小鼠能誘發特異的體液和細胞免疫應答，對小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保護效力。rpfC蛋白[18]是一種復蘇促進因子，作為亞單位疫苗免疫C57BL/6小鼠，可誘導機體產生特異性IgG抗體，刺激T細胞分泌高水平的Th1型細胞因子(如IFN-γ和IL-12)和低水平的Th2型細胞因子(如IL-4和IL-5)，并延長結核感染小鼠的存活時間，降低其肺和脾臟中MTB數量，證明該蛋白具有一定的免疫保護作用，可作為候選疫苗組分之一。因此，W541作為疫苗可能誘導保護性免疫在抗結核感染中發揮重要作用。

W541蛋白與人類蛋白的同源性極低，若作為疫苗免疫后，不會與人類蛋白產生交叉反應，不會引起自身免疫性疾病。因此，W541具有較好的安全性。

綜上所述，本研究采用生物信息學方法預測MTB W541蛋白具有多個潛在的T、B細胞抗原表位，其中以T細胞抗原表位占優勢，作為疫苗的免疫原可能誘導保護性免疫應答，并發揮重要的調控作用，可作為候選疫苗進一步進行動物試驗評價。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻李鵬川：起草文章；梁艷、張林西和吳雪瓊：指導文章撰寫工作、對文章的知識性內容作批評性審閱