宏基因組二代測序和GeneXpert MTB/RIF對結核病診斷價值的Meta分析

王雅娟 曹新益 劉升明

結核病感染率高、死亡率高，但對其診斷不盡如人意[1]。在傳統的結核分枝桿菌病原診斷手段中，涂片鏡檢的敏感度低且無法區分其他抗酸桿菌，而培養周期長，又不利于早期診斷。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)是一種核酸擴增技術，因敏感度和特異度較高且周期短等優點，已在2010年被世界衛生組織推薦用于結核病快速診斷和利福平耐藥性篩查[2]，目前也在我國較廣泛地應用。但2020年全球肺結核病原檢出率較2019年僅提高了2%，且各地區間檢出率差異較大[1]，因此，臨床仍需探索更快速有效的診斷方法。

隨著宏基因組二代測序技術(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)的發展，其在臨床微生物檢測中的應用越來越廣泛，并顯示出良好的綜合應用價值[3]。然而，目前比較mNGS與Xpert對結核病診斷價值的研究多以小樣本為主，且所得結果存在一定差異。因此，筆者對使用mNGS和Xpert診斷結核病準確性的文獻進行薈萃分析，比較兩種方法在結核病診斷中的應用價值并進行綜合評價，為優化臨床快速診斷能力及加強治療和管理提供參考。

資料和方法

一、文獻來源及檢索策略

系統檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、Web of Science、中國知網(CNKI)、中國生物醫學文獻數據庫(CBM)、萬方和維普數據庫自建庫至2022年7月5日公開發表的關于mNGS與Xpert診斷結核病準確性的文獻。檢索策略為“主題詞+自由詞”，中文檢索詞為：結核、結核分枝桿菌感染、分枝桿菌感染、宏基因組二代測序、高通量測序、二代測序、利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術等；英文檢索詞為：Tuberculosis、Mycobacteriumtuberculosisinfection、TB、Kochs disease、Metagenomic next-generation sequencing、Next-generation sequencing、mNGS、NGS、Xpert MTB/RIF、GeneXpert MTB/RIF、Xpert、GeneXpert等。以Embase數據庫為例的檢索策略見表1。

表1 以Embase數據庫為例的檢索策略

納入標準：(1)研究目的：比較mNGS和Xpert診斷結核病的準確性；(2)研究對象：根據臨床表現、影像學檢查等疑診為結核病患者；(3)檢測手段：同時予mNGS和Xpert檢測；(4)參考標準：培養或臨床綜合診斷結果；(5)結局指標：有足夠建立診斷效能分析的四格表數據，即真陽性(true positive，TP)值、假陽性(false positive，FP)值、假陰性(false negative，FN)值、真陰性(true negative，TN)值。

排除標準：(1)文獻類型為病例報告、綜述、 會議論文、評論、摘要、信件、專家意見和動物實驗；(2)重復文獻；(3)無法獲取全文文獻。

二、研究方法

1.文獻篩選及數據提取：由2名研究者根據納排標準獨立篩選和納入文獻，以預先制定的資料表提取數據，若結果有分歧則通過小組協商解決。提取的資料包括第一作者、發表年份、研究設計、地區、樣本來源、樣本量、樣本年齡和性別組成、標本類型、檢測方法、參考標準、TP值、FP值、FN值和TN值等。

2.偏倚風險和適用性評價：使用診斷準確性試驗質量評價工具(quality assessment of diagnostic accuracy studies-2，QUADAS-2)[4]對所有最終納入文獻分別從偏倚風險和適用性兩方面進行評價，評價內容包括病例選擇、待評價試驗、參考標準、流程與進展4個部分。滿足評價標準為“是”，不滿足評價標準為“否”，部分滿足或描述不詳細為“不清楚”。每個部分中所有問題均回答為“是”時即為“低風險(low risk)”，其中任一問題回答為“否”即為“高風險(high risk)”，其他情況為“不清楚風險(unclear risk)”。評價過程由2名研究者獨立完成，必要時小組協商決定。

三、統計學處理

采用R 4.2.0和R Studio 2022.07.0+548軟件、meta 5.5-0和mada 0.5.11軟件包及其依賴包進行資料的統計分析。

1.診斷準確性試驗評價指標：根據四格表數據分別計算每個納入研究待評價試驗的敏感度、特異度、診斷比值比及其95%可信區間(95%CI)；采用mada軟件包雙變量模型擬合綜合受試者工作特征曲線(SROC曲線)，并計算其曲線下面積(AUC)。

2.異質性分析：(1)閾值效應檢驗：計算敏感度與(1-特異度)對數的Spearman相關系數r，若相關系數r>0.6、P<0.05或SROC曲線呈典型“肩臂狀”分布，即提示存在閾值效應，此時通過 AUC值評價診斷效能，否則進一步合并效應量；(2)非閾值效應檢驗：通過I2統計量和Cochrane-Q檢驗進行評估，若I2>50%(代表中度以上的異質性)、P<0.05，則采用隨機效應模型合并效應量以部分消除異質性對結果的影響，否則采用固定效應模型。根據不同的標本進行亞組分析。

3.發表偏倚分析：采用Deeks漏斗圖檢驗發表偏倚，檢驗水準α=0.05。

4.敏感性分析：分別以敏感度、特異度和診斷比值比作為敏感性分析指標，采用逐一剔除文獻法，以評價本研究所得結果的穩定性。

結 果

一、文獻檢索結果及納入研究的基本特征

共檢索到666篇文獻，根據納排標準，最終納入12篇文獻[5-16]，包括中文文獻5篇(即文獻5～7、11和 15)、英文文獻7篇(即文獻8～10、12～14和16)；其中，文獻5、14和15無mNGS和Xpert并聯診斷的完整四格表資料。共納入1344例患者，其中，檢測肺組織標本(不包括胸腔積液和淋巴結)685例、肺外組織標本659例；最終871例診斷為結核病，包括肺結核412例和肺外結核459例。文獻篩選流程見圖1，納入研究文獻基本信息及數據資料見表2、3。

表2 納入研究文獻的基本信息

圖1 文獻篩選流程圖

二、偏倚風險和適用性分析結果

QUADAS-2量表評價結果顯示，12篇文獻均未提及詳細的盲法設計方案。“病例選擇”部分，文獻11采用病例-對照設計被判斷為“高風險”；“參考標準”部分，文獻8、10和14的參考標準包含mNGS或Xpert檢測陽性，文獻13包含Xpert檢測陽性，故均被判斷為“高風險”，其余各部分文獻評價均無“高風險”，具體見表4。

表3 納入研究文獻的原始數據資料 (例)

表4 納入研究的QUADAS-2量表風險評價結果

三、Meta分析結果

1.診斷準確性試驗評價指標：根據表3數據分別計算各納入研究中mNGS、Xpert和mNGS+Xpert檢測方法的敏感度、特異度、診斷比值比及其95%CI，具體見表5。再繪制3種檢測方法的SROC曲線，獲得AUC值分別為0.931、0.860和0.978(圖2)。

表5 納入研究的診斷準確性試驗評價指標

續表5

圖2 三種檢測方法診斷結核病的綜合受試者工作特征曲線

2.異質性檢驗：(1)閾值效應檢驗：mNGS、Xpert和mNGS+Xpert 檢測方法的Spearman相關系數r分別為：-0.119(P=0.712)、0.403(P=0.194)和-0.527(P=0.145)，均不存在明顯閾值效應。(2)非閾值效應檢驗：mNGS檢測的敏感度、特異度、診斷比值比的I2統計量和Cochrane-Q檢驗結果分別為I2=92.3%和P<0.01、I2=0.0%和P=0.896、I2=0.0%和P=0.716；Xpert的結果分別為I2=90.0%和P<0.01、I2=0.0%和P=0.732、I2=36.5%和P=0.098；mNGS+Xpert的結果分別為I2=92.3%和P<0.01、I2=0.0%和P=0.951、I2=0.0%和P=0.436。各研究間mNGS、Xpert及mNGS+Xpert并聯診斷的敏感度異質性均有統計學意義，采用隨機效應模型合并效應量；特異度和診斷比值比的異質性均無統計學意義，采用固定效應模型進行合并。

3.合并分析結果：mNGS診斷結核病的合并敏感度、合并特異度、合并診斷比值比及其95%CI分別為：63.4%(54.4%～73.8%)、99.8%(98.9%～100.0%)和58.6(29.6～115.8)，Xpert分別為50.3%(41.2%～61.3%)、99.9%(99.1%～100.0%)和23.8(12.3～46.0)，mNGS+Xpert分別為68.7%(60.1%～78.6%)、99.8%(98.9%～100.0%)和91.2(40.2～207.3)(圖3～5)。進一步根據標本類型，將納入研究分為肺泡灌洗液組、腦脊液組、其他肺外(不包含腦脊液)或多部位標本組，分析mNGS、Xpert及兩者并聯診斷在各組中的合并敏感度及特異度(表6)。

表6 mNGS、Xpert及兩者并聯診斷在不同類型標本中的合并診斷效能

圖3 mNGS診斷結核病的敏感度、特異度和診斷比值比森林圖

圖4 Xpert診斷結核病的敏感度、特異度和診斷比值比森林圖

圖5 mNGS+Xpert診斷結核病的敏感度、特異度和診斷比值比森林圖

4.發表偏倚：采用Deeks漏斗圖進行發表偏倚檢驗(圖6)，結果顯示：mNGS、Xpert和mNGS+Xpert三種檢測方法均存在發表偏倚(P=0.013、0.010、0.033)。

圖6 mNGS、Xpert和mNGS+Xpert三種檢測方法的發表偏倚Deeks漏斗圖分析

5.敏感性分析：分別對合并敏感度、特異度、診斷比值比進行敏感性分析，逐一剔除各項研究，結果顯示，所得合并統計量差異均無統計學意義，研究所得結果較為穩定。具體見圖7～9。

圖7 mNGS的敏感性分析結果

圖8 Xpert的敏感性分析結果

圖9 mNGS+Xpert的敏感性分析結果

討 論

全球結核病防治是一場持久戰，早期診斷在其中具有舉足輕重的地位。當前的許多研究均表明了mNGS和Xpert相較于傳統檢測方法的優勢，但受限于mNGS和Xpert較高的檢測成本，臨床上較少將其聯合應用于臨床一線診斷。因此，有必要比較兩者診斷結核病的效能，以供臨床選擇和參考，但目前尚缺少比較兩者對結核病診斷準確性試驗的Meta 分析。

本文對納入的12項研究進行了薈萃分析，以綜合比較mNGS和Xpert診斷結核病的準確性。綜合分析顯示，mNGS和Xpert均具有良好的結核病診斷能力，其中，前者合并敏感度、合并診斷比值比及AUC值均較Xpert高；而且，將二者聯合后的診斷效能更高，明顯提高了合并敏感度和診斷比值比，AUC值達到了0.978。此外，兩種檢測方法及其聯合檢測的合并特異度均>95%，差異不大，提示誤診率均較低。

既往研究表明，標本類型可影響mNGS和Xpert診斷結核病的敏感度和特異度[17-20]，這可能是本次Meta分析納入的研究在敏感度方面異質性較大的原因。本研究根據標本類型進一步將納入的研究分為3組，Meta分析得出：Xpert檢測肺泡灌洗液的敏感度最高(63.8%)，與mNGS檢測的敏感度相差不大(64.3%)，而在腦脊液中的檢出最低(41.8%)；mNGS在腦脊液組和其他肺外或多部位標本組中的檢測敏感度(64.6%和60.8%)均優于Xpert(41.8%和50.8%)，但兩者檢測不同標本類型的特異度無明顯差異，且均>95%。另外，本文納入的文獻參考標準不完全一致，其中有2篇參考標準為臨床診斷，1篇為液體培養，其他均為病原學加臨床復合診斷，這也可能造成研究結果的異質性。通過進一步行敏感性分析表明，剔除任一篇文獻后所得的合并敏感度、特異度、診斷比值比均無明顯變化，可認為所得結果較為可靠。

本研究尚存在以下不足：首先，納入的12項研究中，研究地區均為中國，患者年齡均>18歲，缺少結核病低負擔地區及兒童結核病相關的研究，不同發病率地區和兒童檢測標本可能會影響mNGS和Xpert的診斷效能[17, 21-22]。其次，雖然本研究進一步對標本類型進行了分組分析，但并未發現造成異質性的具體來源。此外，Deeks檢驗提示不排除存在發表偏倚，可能會造成所得診斷效能的高估，今后需納入更多新的研究進行分析。最后，雖然mNGS在診斷感染性疾病中有諸多優勢，但要注意的是，在臨床應用前，往往還需要區分定植菌、污染菌以及對報告進行準確解讀[23]。

綜上所述，mNGS和Xpert對結核病診斷均具有應用價值，且Xpert聯合mNGS檢測和mNGS單一檢測的總體敏感度均高于Xpert，而特異度相差不大。鑒于檢測成本等問題，筆者建議mNGS檢測可應用于危重癥、混合感染等復雜病例；而對Xpert檢測陰性但臨床仍懷疑結核分枝桿菌感染的病例，尤其是肺外結核，Xpert聯合mNGS檢測也有望提高病原檢出率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻王雅娟：直接參與研究方案設計、實施研究和撰寫文章；曹新益：參與采集數據、分析和解釋數據；劉升明：直接參與研究方案設計、指導研究實施和審閱文章