淺析聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗中常見問題及解決方法

毛秀榮，李 雷，朱 俊，鄧繼武，石 榴，朱勇強，祝陳英，郭丹蝶

(四川省達州市種子管理站，四川 達州 635000)

種業提升計劃的推行，我國培育審定和登記的農作物品種逐年增多，據報道，截止2018年底全國選育農作物品種4萬多個。農業產業的快速發展和消費市場的日益變化，品種更新換代顯著加快，市場和產業基地中同名異物、同物異名、一物多名、一名多物，以假充真、魚目混珠等現象時有發生。同時，轉基因技術等新型育種技術的應用，使單一性狀的改變成為可能，在原品種基礎上改良少數或者單個性狀的派生性品種大大增加，這給品種的鑒定篩選、選育、保護及種質資源的生產、經營、管理、維權等帶來了不同程度的困難，甚至給農民帶來了巨大的經濟損失。學術和實踐中，基于基因表達型的形態學標記、孢粉學標記、細胞學標記和同工酶標記，以及直接反映DNA水平差異的分子標記都是較為常用的鑒定方法。但形態學標記易受環境條件與人為觀測因素影響，同時存在標記數量少、多態性差等缺點。孢粉學標記不適合用于同種不同品種間親緣關系的研究，在同種質類型內的意義不大。細胞學標記信息挖掘需要大量的人力和時間，而標記的數量有限；同工酶種類較少，且對不同果樹品種的鑒定能力不強，在實際應用中更是難以辨別出品系間的差異。分子標記最大的優點是能夠準確且直接展現基因組DNA的差異，因而具有更高的準確性和穩定性。為此，文章以筆者在聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗過程中遇到的實際問題為例，對問題產生的原因和可能的解決辦法進行了探討分析，以期為聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗的順利開展和真實數據的獲得提供啟示和幫助。

1 條帶圖譜不理想

1.1 未檢測到目標條帶

未檢測到目標條帶甚至無條帶，最可能出現的原因一是PCR產物跑出凝膠；二是PCR未有效擴增，未獲得足夠有效的PCR產物。問題一解決思路是降低產物在PAGE膠中的移動速度，可降低電壓、縮短電泳時間，參考maker條帶的在凝膠的位置，結合目標條帶的大小，判斷是目標條帶否跑出凝膠。接通電源，在5V/cm(長度以兩個點極之間的距離計算)條件下電泳30～40min，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣孔的一端)。問題二解決思路，首要保障引物質量，確定PCR反應體系的配置，包括模板、引物、MIX混合液和水的配置比例等，其次是PCR擴增程序是否合理，引物的來源，建議通過一級數據庫NCBI、GDR等(原始文獻)查詢獲得。

1.2 出現非特異性擴增帶

在真實性實驗中，非特異性條帶并不是我們想要的，非特異性擴增帶的出現最可能的原因一是引物的選擇，二是引物的退火溫度，三是PCR擴增循環次數過大，PCR擴增過程中延伸時間過長，循環數多，非特異性產物量也隨之增多。問題一、二解決思路是要找到最適合的引物，以高差異性品種為模板，通過多次引物適宜性和多態性篩選，選取合適的引物。同時，以0.5～1℃為梯度，篩選最適合退火溫度(可將退火溫度相近的引物一起篩選，提高效率)。問題三可適當減少PCR循環次數，適當提高退火溫度，使得擴增產物穩定，在實際實驗中經過多次對比分析，35個循環較為合適。

1.3 出現拖帶或彌散

出現這種情況的原因是多方面的，聚丙烯膠在配置過程中未充分混勻，導致分離效果不明顯，出現條帶彌散。所以配置聚丙烯膠時一定要仔細，不可漏加，少加藥品，還需充分搖勻。電泳液也要勤換，這樣才能保證電泳效果；同時，點樣時只圖速度，所點樣品飄散在加樣孔，也造成圖譜拖帶或者空白。因此，移液槍點樣一般1～3μL，且速度要緩慢，注意盡量不要吸到石蠟油，待樣液自然落入樣孔底部，所得帶型清晰、美觀。

1.4 出現圖譜很淡，呈灰色

問題可能是一PCR擴增產物量過少，二是銀染時間不足。擴增產物不足，可以選擇增加點樣量，一般108孔的可以選擇0.8～1.2uL，孔越大加樣量越大。考慮硝酸銀易吸水和見光分解，可適當提高硝酸銀溶液的濃度，延長染色的時間，及時將使用后的硝酸銀置于棕色瓶低溫避光保存。顯色液配置時要先加氫氧化鈉，待后氫氧化鈉溶解完全溫度降低室溫時再加入甲醛，低溫保存，減少甲醛揮發，保證顯影液質量。搖床晃動染色、顯色時，用純水沖洗過的玻璃棒將重疊在一起的膠塊輕輕撥開，使得每塊膠均勻染色，以保證圖譜質量和清晰度。

1.5 條帶彎曲、不整齊

問題可能一是聚丙烯酰氨凝膠不均勻，二是電泳液緩沖能力下降。問題一的解決思路:均勻制作凝膠版，可先將膠液、凝固劑、加速劑分別配置母液，使用時在稀釋混勻。在實際操作中，通過灌膠時適當加大電泳槽傾斜角、減緩灌膠速度，減少膠中的氣泡。制作好的膠放入垂直電泳槽時，從一邊緩緩浸入，排除膠板底部間隙氣泡，確保兩邊受力一致，避免膠帶損壞。電泳液使用時間較長，離子濃度降低，pH上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。問題二的解決思路:建議配置好的緩沖液用PH試紙測溶液強度，連續使用，每星期更換1次電泳緩沖液最佳。

2 DNA質量控制不當

2.1 DNA溶液反復凍融

由于基因組DNA反復凍融，導致DNA含量下降。因此建議對提取的DNA分裝保存，需要使用時取出，融化后應該立即使用，使用結束后，剩余DNA及時于4℃冰箱中保存。同時，DNA存放時間不宜超過14d，時間過長導致降解，試驗徒勞無功。

2.2 DNA質量不高

由于陳種子提取的DNA純度低，擴增效果差，導致結果不明顯或者帶型不一致的，干擾結果分析。采取室內發芽獲取幼嫩植物組織，CTAB法提取DNA。也可采集鮮葉放于自封袋中，并加入100-200 g變色硅膠，使硅膠與葉片的質量比在20:1左右，同時輕微搖動使硅膠與葉片接觸充分、均勻，常溫放置，可長時間保存用于DNA提取。DNA提取后應當進行質量檢測，一是通過1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶亮度、形狀，有無彌散、拖尾、蛋白污染等。二是通過濃度檢測，一般合格的DNAOD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA較純。幼苗提取的DNA濃度較高，需要稀釋20ng/μL備用，原液置于-20℃保存，稀釋液置于4℃保存使用。

3 點樣過程不規范

3.1 點樣不方便

由于購買的樣梳齒子太長，點樣孔過深，長槍頭不能觸及樣孔底部，樣液不能全部、快速落入底部，所得圖譜不夠清晰，影響圖譜分析。在實際實驗中可用剪刀剪去樣梳齒子長度的四分之一，這樣移液槍點樣時，樣品自然、快速落入底部，不會彌散在孔中，提高了圖譜分析時的辨識度。

3.2 點樣方法不當

點樣前注意移液槍吸樣，將搶頭伸到底部，吸樣后稍停留待長頭搶充分吸取樣液，再加入樣孔底部；點樣時，為避免邊緣效應，最好左右兩端空幾個點樣孔，然后再加樣，這樣可以避免兩邊膠孔拔時斷裂，加樣串孔。在實驗中如有多人，大批量做檢驗，必須用maker做好標記，膠板左、中、右部分至少留有一條Maker，以便分析條帶，比對圖譜。

4 引物存放不當

制作模板時，稍有不慎可能會有不換槍頭吸取另一引物的情況，此時就造成了引物整管污染，出現雜帶，干擾結果分析；引物多次反復凍融，會使得其存放時間變短，所得圖譜明顯沒有剛開始亮。為防止不規范操作造成引物污染及多次凍融導致引物變質降解，我們將稀釋后的前后引物混合并裝，可有效減少加樣次數，在-20℃冰箱保存，就可避免整管被污染和反復凍融失效。

5 硝酸銀用量不當或存放過長失效

在染色時，應待硝酸銀完全溶解并混勻后才可倒入，否則銀顆粒會潛入膠中，使得背景雜亂。硝酸銀量不足會使DNA帶變淺，硝酸銀失效，導致膠板變空白；量過多，導致較多銀離子殘留在膠板上，背景深而影響顯帶。因此，在試驗中若染色不佳，可適當的多加硝酸銀或適當的延長染色時間，以保證染色效果。

6 膠帶的長期保存

顯色完全用后清水洗去殘留的顯影液和硝酸銀液后，可以用保鮮薄膜將膠帶完全包裹，并用除去膠帶上多余的水，用馬克筆在膜上記下相關重要信息，置于低溫下可長時間保存備用。

聚丙烯酰氨凝膠電泳檢驗檢測準確性高、實用性強，但試驗步驟繁瑣，耗時較長，因此，檢驗人員在聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗過程中必須嚴謹、細致，需進一步加強專業素養，提升操作技能，為品種檢測、鑒定把好質量關。