山東泰山地區(qū)獼猴桃品種間抗寒性調(diào)查與分析

李健，毛可欣，王海榮，安淼，劉光柱，李國田

摘要：【目的】獼猴桃作為富含維生素的“水果之王”深受群眾喜愛，但近年來多地發(fā)生凍害情況，給獼猴桃生產(chǎn)帶來巨大損失，該研究針對獼猴桃凍害、生理指標、基因表達進行了分析，以便為獼猴桃抗寒性研究提供理論基礎(chǔ)。【方法】對4年生‘泰山1號‘ 徐香等10個獼猴桃品種，于2月17日觀察凍傷切面，于2021年3月15日和2021年3月25日，隨機選取一個品種的3個植株，每個植株隨機選取兩個枝條，統(tǒng)計萌芽率。同時對生理指標丙二醛、可溶性糖、脯氨酸、電導率、超氧化物歧化酶（SOD）進行了測定。【結(jié)果】通過試驗，從分子、表觀層面分析了不同獼猴桃品種間抗寒性的差異，發(fā)現(xiàn)軟棗、中華系獼猴桃抗寒性強于美味系獼猴桃，得到了適于山東泰山地區(qū)生產(chǎn)的‘泰山1號‘臍紅‘金紅50和‘龍成2號獼猴桃品種，部分美味系獼猴桃抗寒性太差，不適合山東地區(qū)種植。該研究可以通過生理指標、基因表達情況選擇更為抗寒的獼猴桃品種，可以開發(fā)抗寒性分子標記，以快速篩選抗寒品種。

關(guān)鍵詞：山東泰山;獼猴桃;抗寒性分析

文章編號：2096-8108（2022）02-0021-06中圖分類號：S663.4文獻標識碼：A

Investigation and Analysis of Cold Resistance among Kiwifruit Cultivars in Taishan Area， Shandong Province

LI Jian1， MAO Kexin1，2， WANG Hairong1， AN Miao1， LIU Guangzhu3，LI Guotian1*

（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2.Shandong Agricultural University， Taian 271000，China;

3.Feicheng Peach Industry Development Center，F(xiàn)eicheng 271600，China）

Abstract：【Objective】 Kiwifruit， as the ‘king of fruits， which is rich in vitamins， is loved by the consumers. But in recent years， many reports have been reported about the freezing injury， which has brought great losses to kiwifruit yield. In order to provide theoretical basis for research on cold resistance of Kiwifruit， this study analyzed freezing injury， physiological indexes and gene expression of Kiwifruit.【Method】 Ten kiwifruit varieties， including four-year-old taishan No.1 and Xuxiang， were randomly selected on March 15， 2021 and March 25， 2021 to observe the frostbite section on February 17. Three plants of a variety were randomly selected on March 15， 2021 and two branches of each plant were randomly selected to count the germination rate. At the same time， the physiological indexes malondialdehyde， soluble sugar， proline， electrical conductivity and superoxide dismutase （SOD） were determined.【Results】The differences in cold resistance between different kiwifruit cultivars were analyzed from molecular and apparent levels. It was found that the cold resistance of Actinidia arguta and Actinidia chinensis was stronger than that of Actinidia deliciosa. The kiwifruit cultivars ‘Taishan 1， ‘Qihong， ‘Jinhong 50 and ‘Longcheng 2 suitable for growing in Taishan area of Shandong Province， part of the delicious department of kiwi cold resistance is too poor， not suitable for shandong planting.This study can select more cold-resistant kiwifruit varieties through physiological indicators and gene expression， and develop cold-resistant molecular markers to quickly screen cold-resistant varieties.

Keywords：Taishan area of Shandong; kiwifruit; cold resistance analysis

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）富含維生素C，被譽為“水果之王”，屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）藤本植物。原產(chǎn)于中國，主要分布于N20°至N50°[1]，我國獼猴桃自然資源豐富，種植廣泛，深受群眾喜愛。影響獼猴桃產(chǎn)量的因素主要有氣候、病蟲害、水肥條件等，其中凍害及早晚霜對獼猴桃生長帶來嚴峻考驗。此外，獼猴桃種間抗寒性參差不齊，同一品種在不同氣候、栽培條件下其抗寒能力也存在差異[2]，加之盲目引種、管理不當，南種北引往往造成嚴重損失。其中美味、中華獼猴桃兩個主栽種主要分布在黃河以南，耐寒性較差，最低耐受-10 ℃左右[3]。隨著近年來極端低溫天氣的增多，全國每年都有大批獼猴桃種植區(qū)遭受凍害，僅陜西省寶雞市在1991-2016年間的凍害面積就達3.57萬hm2[4]。

凍害發(fā)生在早春可以使幼葉、芽、花蕾發(fā)生壞死；凍害發(fā)生在深秋可以造成樹干及新枝凍傷，降低植株休眠時對低溫的耐受力；凍害發(fā)生于冬季能使枝干斷裂、休眠芽凍傷，最終導致其無法正常萌發(fā)[5]，凍害不僅對獼猴桃正常生長造成影響，還會造成減產(chǎn)，甚至大面積死亡。2021年1月上旬遭遇了近-20 ℃極端低溫天氣，本研究以山東省果樹研究所泰東試驗基地‘泰山1號‘徐香等北方主栽品種為材料，于2020年11月-2021年4月取材試驗和調(diào)查，對獼猴桃凍害、生理指標、基因表達進行了分析，為獼猴桃抗寒性研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植株為4年生‘泰山1號‘徐香等共10個獼猴桃品種，位于山東省果樹研究所泰東科研基地，東經(jīng)116°20′～117°59′、北緯35°38′～36°28′，年平均降水量697 mm，屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候，土壤為中性偏酸沙壤土，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)1%，堿解氮質(zhì)量分數(shù)19～43 mg/kg，磷質(zhì)量分數(shù)21～34 mg/kg，鉀質(zhì)量分數(shù)32～68 mg/kg。轉(zhuǎn)錄組與生理指標測定為‘泰山1號‘徐香‘臍紅‘龍成2號4個品種，直徑為0.5～0.8 cm的1年生新枝作為樣本，2020年11月15日至2021年4月15日共取6次。

1.2試驗方法

極端低溫出現(xiàn)于2021年1月6日-7日，凍傷切面觀察于2月17日。萌芽率統(tǒng)計于2021年3月15日和2021年3月25日，隨機選取一個品種的3個植株，每個植株隨機選取兩個枝條。萌芽率=萌發(fā)芽數(shù)/總數(shù)×100%。

生理指標測定：將取得的枝條液氮速凍后用磨樣機磨成粉末，按0.1 g分裝到不同離心管。丙二醛測定使用TCA法、可溶性糖測定使用蒽酮法、脯氨酸測定使用茚三酮法。電導率測定使用雷磁公司的DDS-307型電導率儀。超氧化物歧化酶（SOD）測定使用格銳思生物公司的WST法試劑盒，貨號G0101F。

基因表達熱圖數(shù)據(jù)來源于美吉生物轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，合同編號：MJ20201116080。

2結(jié)果與分析

2.1試驗地氣溫變化

由試驗地氣溫趨勢圖（見圖1）可以發(fā)現(xiàn)，11月下旬溫度急劇下降，1月6日最低氣溫達到最低峰-19 ℃，1月7日最高氣溫達到最低峰-8 ℃，隨后氣溫逐漸升高。采樣時的日期溫度分別為7～19 ℃、-10～2 ℃、-8～7 ℃、-2～8 ℃、4-16 ℃、7～19 ℃，其中1月15日所取樣品為經(jīng)歷極端低溫后的枝條。

2.2獼猴桃不同品種生理指標測定

通過對6個時間點枝條生理指標丙二醛、相對電導率、可溶性糖、脯氨酸和SOD酶活的測定（見圖2），丙二醛質(zhì)量分數(shù)在1月15-2月15日到達頂峰隨后下降，相對電導率總體呈上升趨勢。可溶性糖含量緩慢上升至1月15日，隨后一直下降，降至峰值的0.3～0.4，脯氨酸質(zhì)量分數(shù)在3月15日達到頂峰，隨后下降。SOD酶活在11月15日-1月15日和3月15日-4月15日兩個時段內(nèi)都有升高趨勢。可以看出，在寒冷的氣溫下，獼猴桃膜損傷程度（丙二醛、相對電導率）上升，隨著溫度回暖膜損傷程度下降；另外，像可溶性糖、脯氨酸等抗凍性內(nèi)溶物在低溫下含量也有一定升高；過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，在低溫脅迫后SOD酶活升高，提高抗逆性。由不同生理指標結(jié)果可以看出，‘泰山1號與‘龍成2號抗寒能力最強，其次為‘臍紅，抗寒性最差的是‘徐香。

2.3獼猴桃不同品種抗寒相關(guān)基因表達分析

對試驗基地內(nèi)4個獼猴桃品種枝條進行轉(zhuǎn)錄組測序，選取了26個植物抗寒相關(guān)基因進行表達熱圖繪制（見圖3），1-6列分別表示2020年11月-2021年4月。基因的表達模式在4個品種內(nèi)基本一致，其中抗寒基因HT1-2、HT1-3在12月、1月低溫脅迫下表達量提高，而轉(zhuǎn)錄因子CBF5、CBF6在降溫過程中表達量有所下降，這與其低溫下過多結(jié)合冷誘導基因COR有關(guān)。植物抗氧化系統(tǒng)中SOD2、SOD3、CAT、POD等基因在降溫過程中表達量上升，溫度回升后其表達量隨之下降。乙烯應(yīng)答元件組合蛋白AP2/ERF、參與ABA信號轉(zhuǎn)導的PYL9在氣溫降低后表達量迅速提高，最高可達12.85倍。個別基因的表達模式在不同品種間有差異，調(diào)控維生素C質(zhì)量分數(shù)的AsA基因在‘泰山1號‘徐香中低溫下表達量升高，在‘臍紅中變化較小，而在‘龍成2號中有降低的趨勢；MYB44基因在低溫下表達量提高，而在‘龍成2號中未檢測到其表達，推測這與品種差異有關(guān)，‘龍成2號屬于軟棗獼猴桃，較中華、美味獼猴桃差異更大。

2.4極端低溫下獼猴桃不同品種凍害調(diào)查分析由于試驗地區(qū)1月6日左右遭遇了-19 ℃極寒溫度，造成了獼猴桃不同程度凍害，于2月中旬進行了10個品種的凍害調(diào)查。用刀片切開樹皮露出形成層進行觀察后發(fā)現(xiàn)（見圖4），‘徐香獼猴桃凍害最為嚴重，下部形成層發(fā)黑褐色，‘泰山1號和‘金桃受到輕微凍害，其余品種形成層呈現(xiàn)綠色。通過調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，獼猴桃形成凍害部位主要是離地20 cm以內(nèi)的下部，而地上中部則凍害較輕，頂部枝條受影響最小。

試驗基地獼猴桃于2021年3月上旬開始萌動，3月15日和3月25日分別統(tǒng)計獼猴桃萌芽率，死亡率調(diào)查于4月30日（見表1）。由結(jié)果可以看出，3月25日較15日萌芽率不同，正常條件下萌芽率應(yīng)升高，但‘農(nóng)大金獼‘米良1號‘金桃等品種萌芽率下降幅度較大，這與植株受凍傷有關(guān)，導致上部枝條供水供養(yǎng)不足。‘徐香凍害最為嚴重，萌芽率只有21.67%，而死亡率卻高達63.64%，‘金魁凍害情況次之，這兩個品種都屬于美味系獼猴桃。抗凍能力較好的品種為‘泰山1號‘臍紅‘金紅50和‘龍成2號，此為中華系和軟棗獼猴桃，適于山東泰山地區(qū)種植。

3討論

從研究結(jié)果不難看出，獼猴桃品種間抗寒性存在明顯差異，總體來看軟棗、中華系獼猴桃抗寒能力高于美味系獼猴桃，但中華獼猴桃‘農(nóng)大金獼凍害比美味獼猴桃‘米良1號‘翠香嚴重。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖質(zhì)量分數(shù)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)可以一定程度反映植物抗寒能力的強弱[6]。有研究表明，低淀粉高可溶性糖的軟棗獼猴桃抗寒能力高于其他軟棗獼猴桃[7]。本研究中，4個品種可溶性糖質(zhì)量分數(shù)都在低溫凍害時上升，隨溫度回升后又下降，品種間差異不明顯，但受凍害時脯氨酸質(zhì)量分數(shù)‘泰山1號>‘龍成2號>‘臍紅>‘徐香，確實反映了品種間抗寒能力。當然，丙二醛、相對電導率、SOD也能一定程度反映膜損傷程度，低溫下植物SOD活性應(yīng)該是先上升后下降，其下降到一定程度O2-會降低[8-9]。

植物抗寒性受多基因共同調(diào)控，隨著植物抗寒性研究的不斷深入，抗寒基因被不斷地挖掘[10]。轉(zhuǎn)錄因子CBF是植物抗寒體系重要節(jié)點基因，可調(diào)節(jié)下游COR、BAM[11]基因，過表達CBF可使植株SOD活性提高低溫抗性增強，同時也能影響赤霉素、生長素、脫落酸調(diào)節(jié)枝條休眠及落葉[12]。本研究中，CBF基因在氣溫降低過程中表達量有下降趨勢，與其結(jié)合并調(diào)控下游抗寒基因密不可分。獼猴桃抗氧化系統(tǒng)SOD2、SOD3、CAT、POD17、AsA等基因在降溫過程中表達量升高，與此同時生理指標SOD酶活也升高，抗氧化系統(tǒng)有效降低植物O2-濃度，從而調(diào)節(jié)細胞膜透性、增強細胞膜穩(wěn)定性，保護植物體正常代謝[13]。植物生長素響應(yīng)因子ARF參與植物生長發(fā)育各過程，最近許多研究表明植物ARF在環(huán)境脅迫響應(yīng)也有重要作用[14]，其可參與磷酸鹽脅迫[15]、鹽和干旱脅迫[16]等，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫下ARF7表達量下降，溫度回升后表達量提高。擴展蛋白（expansin），是一類提高植物細胞壁韌性的細胞壁蛋白[17]，廣泛參與植物生長各階段、多種逆境脅迫[18]，本研究中expansin LA1在低溫過程中表達量上升，提高了獼猴桃抗寒性。獼猴桃抗寒是一個由多基因共同調(diào)控的復雜過程，基因表達的研究有助于抗寒品種的分子篩選工作。

獼猴桃不同品種抗寒性確實存在差異，結(jié)果顯示，10個品種中抗寒性最弱的為‘徐香‘金魁‘農(nóng)大金獼，抗寒性最好的品種為‘泰山1號‘龍成2號‘金紅50和‘臍紅。相對而言，山東泰山地區(qū)軟棗、中華系獼猴桃的抗寒性要優(yōu)于美味系獼猴桃，這與2009年鄭州地區(qū)[19]、2016年泰山南麓[3]獼猴桃凍害調(diào)查結(jié)果相一致。雖然‘泰山1號中華獼猴桃抗寒性較強，但是今年在山東獼猴桃主產(chǎn)區(qū)淄博[20]卻損失慘重，淄博市有近2 000 hm2獼猴桃[21]，主栽品種‘泰山1號凍害嚴重，有的果園幾乎全部凍死。分析其原因主要有以下幾點：2020年冬季的極端低溫，2021年初遭遇嚴重倒春寒，果園區(qū)塊不同引起冷氣聚集，地勢不同受風力影響較大以及栽培管理設(shè)施有差別等。降低獼猴桃凍害損失需要一定措施，一是應(yīng)該選育和引進抗寒品種；二是要規(guī)范化管理，水肥充足，注意排水，入冬前及時剪枝；三是由于獼猴桃凍害主要發(fā)生于離地10～20 cm處，在冬季可以進行高培土、樹干刷白、捆扎稻草或秸稈；四是可以立擋風墻，一定程度減少冷風；五是在設(shè)施大棚中，防倒春寒可噴灑霧化水汽，防止晝夜溫差大可在白天及時通風、夜間焚燒秸稈。

4結(jié)論

‘泰山1號‘臍紅‘金紅50和‘龍成2號等獼猴桃品種適宜山東泰山地區(qū)種植，部分美味系獼猴桃抗寒性太差，不適合山東地區(qū)種植。可以通過生理指標、基因表達情況選擇更為抗寒的獼猴桃品種，可以開發(fā)抗寒性分子標記，以快速篩選抗寒品種。本研究為山東地區(qū)獼猴桃抗寒品種選育、獼猴桃抗寒性分子研究提供了一定理論基礎(chǔ)。

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