SLC5A8基因甲基化與甲狀腺腫瘤臨床特征及預后相關性的分析*

楊 彥，徐 斌，李玉霞，唐運祥，楊 錢

(重慶市急救醫療中心/重慶市第四人民醫院:1.腫瘤血液科；2.核醫學科；3.普通外科 400014)

作為內分泌系統中的常見腫瘤，甲狀腺腫瘤發病率逐年攀升，嚴重影響居民的身心健康[1-3]。如何提高甲狀腺腫瘤診斷的準確性，識別腫瘤復發轉移的風險是臨床醫生迫切需要思考的問題。隨著分子診斷學的發展，DNA甲基化已成為表觀遺傳學的重要研究機制，在腫瘤形成發展中起到了非常重要的調節作用[4-5]。SLC5A8基因于2002年在甲狀腺中首次被發現，存在于人類染色體的12q13-23，相關研究已證實其有促進腫瘤凋亡和抗腫瘤細胞增殖的作用[6-8]。SLC5A8基因在多種腫瘤組織中呈異常表達狀態，大量研究分析發現，人類大部分腫瘤中均有SLC5A8 基因，例如甲狀腺癌[9]、食管癌[10]、宮頸癌[11]等。目前關于SLC5A8基因甲基化檢測對于甲狀腺腫瘤的良惡性的早期診斷的研究不多，同時針對甲狀腺腫瘤惡變監測及預后評估尚未見相關報道。本研究采用回顧性方法，探討SLC5A8基因甲基化在甲狀腺腫瘤的診斷及預后中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年10月至2019年9月在本院行初次甲狀腺手術的患者，其中男126例，女274例，平均年齡(49.24±4.76)歲。切下新鮮樣本，獲取甲狀腺病灶組織(甲狀腺癌或甲狀腺腺瘤)、癌旁組織(與腫瘤邊緣的間距<0.5 cm)、正常甲狀腺組織(簡稱正常組織，與腫瘤邊緣的間距>2.0 cm，并經病理證實無癌)。不同病理類型標本各取100例，共計400例。100例甲狀腺癌中有分化型甲狀腺癌89例，其中乳頭狀癌83例，濾泡狀癌6例；未分化癌5例；髓樣癌6例。標本均由本院病理科給予確診，切除后立刻放入液氮中保存。患者均簽署知情同意書，符合醫學倫理學規定。納入標準：入組的所有病例均具備明確的手術適應證；具有完整的臨床資料、實驗室檢查結果、病理診斷資料；所有患者否認甲狀腺相關疾病臨床治療史，否認在接受手術治療前有放化療等抗癌治療，否認合并其他類型惡性腫瘤及其他相關遺傳病史；年齡20～70周歲。排除標準：合并有其他甲狀腺疾病者，或有其他類型惡性腫瘤病史。

1.2 臨床資料

收集患者性別、年齡、結節數目、結節大小、是否侵犯包膜、甲狀腺結合球蛋白(TG)、膽固醇、甘油三酯、術前甲狀腺功能、B超特點(是否有鈣化灶、邊界是否清晰、是否有血流信號)、有無淋巴結轉移、TNM分級等信息。臨床資料以患者手術時的住院病例為依據。

1.3 信息隨訪

通過查閱門診病歷、住院病例、打電話形式對患者進行隨訪，隨訪時間自術后起至2021年9月，平均隨訪時間2年。記錄患者最后隨訪日期及疾病狀態(無事件、疾病持續、復發、疾病特異性死亡)，記錄復發類型(局部復發、區域復發、遠處復發)、復發日期等。

1.4 實驗方法

1.4.1引物設計

應用引物設計軟件Primer5并參照Gene Bank自行設計SLC5A8基因引物，交由上海生工生物有限公司協助合成，引物的序列詳見表1。針對SLC5A8基因的DNA序列設計2對引物，進行PCR反應。

表1 引物的序列及擴增片段

1.4.2SLC5A8基因甲基化檢測

采用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測，按照 DNA 提取試劑盒說明書步驟提取標本組織 DNA 并修飾，將對應引物進行亞硫酸氫鹽修飾 DNA 樣本的 PCR 擴增。PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s；58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s，40次循環；72 ℃延伸10 min。擴增完畢后，120 V 電泳30 min，電泳后對反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳照相，甲基化引物擴增后有陽性條帶者發生基因甲基化，未出現條帶的結果為實驗中的陰性對照。

1.4.3SLC5A8基因轉錄水平檢測

采用RT-PCR 法檢測SLC5A8基因mRNA轉錄情況，按照 RNA 提取試劑盒說明書步驟提取樣本組織總RNA，隨后進行反轉錄合成cDNA。采用熒光定量PCR試劑盒對cDNA進行PCR反應。PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃15 s；60 ℃ 40 s,72 ℃ 30 s,40次循環；72 ℃延伸10 min。采集熒光信號PCR結束后，記錄擴增循環數(CT值)。對反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳照相。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 組織中SLC5A8基因甲基化情況

400例標本中，4組間SLC5A8基因甲基化陽性率差異有統計學意義(χ2=130.765，P<0.001)。進一步兩兩比較顯示，癌組織SLC5A8基因甲基化陽性率均顯著高于腺瘤組織(χ2=4.23，P<0.05)、癌旁組織(χ2=64.98，P<0.05)和正常組織(χ2=90.51，P<0.05)；腺瘤組織高于癌旁組織(χ2=29.28,P<0.05)和正常組織(χ2=61.28,P<0.05)。癌旁組織與正常組織比較差異無統計學意義(χ2=3.54，P>0.05)。見表2。

表2 SLC5A8基因甲基化陽性率分析[n(%),n=100]

2.2 組織中SLC5A8基因表達水平

對擴增循環數差值(△CT)進行統計分析，甲狀腺癌組織、腺瘤組織、癌旁組織、正常組織SLC5A8基因表達水平分別為9.54±1.03、8.03±0.99、6.85±0.74、6.30±1.03，組間差異有統計學意義(F=6.324，P=0.033)。這表明SLC5A8基因在癌組織中表達水平較腺瘤組織、癌旁組織及正常組織明顯降低。

2.3 SLC5A8甲基化與甲狀腺腫瘤臨床病理特征的關系

SLC5A8甲基化陽性組與陰性組比較，包膜侵犯、TG水平、膽固醇水平、甘油三酯水平、術前甲狀腺功能及淋巴結轉移差異有統計學意義(P<0.05)，而年齡、性別、結節數量、結節大小等差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 SLC5A8甲基化與臨床特征的關系(n=200)

2.4 甲狀腺腫瘤患者復發率分析

在2年的隨訪中，甲狀腺癌組及甲狀腺腺瘤組中分別有17例及21例患者失訪，甲狀腺腺癌組患者的復發率(13.25%，11/83)顯著低于甲狀腺腺瘤組(29.11% ，23/79)，差異有統計學意義(χ2=9.428，P<0.05)。進一步分析顯示，SLC5A8甲基化陽性患者的復發率(25.67%，20/113)高于甲基化陰性患者(10.20%，5/49)，差異有統計學意義(χ2=4.936，P<0.001)。見圖1。

2.5 甲狀腺腫瘤預后分析

單因素分析顯示，甲狀腺腫瘤預后與SLC5A8甲基化、甲狀腺結節數量、結節大小、包膜侵犯、TG水平、膽固醇水平、術前甲狀腺功能、淋巴結轉移有關。進一步通過Cox回歸分析模型顯示，SLC5A8甲基化、甲狀腺結節數量、結節大小、包膜侵犯、TG水平、術前甲狀腺功能、淋巴結轉移及TNM分級為甲狀腺腫瘤患者預后的影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 甲狀腺腫瘤預后單因素和多因素分析

續表4 甲狀腺腫瘤預后單因素和多因素分析

A：甲狀腺腺瘤于甲狀腺癌患者復發情況比較；B：SLC5A8基因甲基化陽性及陰性患者復發情況比較。

3 討 論

現今，甲狀腺癌已成為內分泌系統最常見的惡性腫瘤，其發病率正在逐年升高[12-13]。鑒于目前對甲狀腺腫瘤的過度診斷及其惰性生長的特性，不少學者反對開展甲狀腺腫瘤的人群篩查，如何快速、準確診斷甲狀腺腫瘤型別仍是當前的臨床難點。目前，DNA甲基化異常已經成為判定腫瘤分子的特異性生物標志物，在腫瘤的早期診斷、預后判斷上具有指導性作用[14-16]。既往研究表明，大部分腫瘤中都會發現SLC5A8 基因，其表達明顯降低或缺失，例如甲狀腺癌、食管癌[10]、乳腺癌[17]等。同時，SLC5A8基因能夠和生物素起反應，可以抑制細胞癌變，殺死癌細胞，加快癌細胞凋亡速度。

本研究通過對不同甲狀腺組織中SLC5A8基因甲基化的檢測情況發現，其在癌組織及腺瘤組織中呈高表達狀態，而其mRNA轉錄水平減弱，與張利紅等[18]研究結果一致，表明SLC5A8基因甲基化在甲狀腺腫瘤中普遍存在。因常規病理檢查中存在潛隱性的可能，不能及時、準確地發現甲狀腺組織惡變，而導致診斷的準確率有所差異，癌旁組織及正常組織中SLC5A8基因甲基化的檢測，從分子水平上彌補了這一缺陷。

早期對甲狀腺癌進行風險等級評定，對避免低危患者因不必要的過度治療帶來的不良反應和精準預測患者的預后情況都具有重要意義。經過為期2年的隨訪發現，甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌的復發率分別為29.11%和13.25%，略高于國內相關研究(8.89%～23.53%)[19-21]，其原因在于本研究中行單側切除術的患者較多，此外部分患者術后未行131I清掃，從而導致復發率升高。既往已有研究表明，DNA甲基化可用于結腸癌[22]、肝癌[16]的診斷與預后評測，本研究結果顯示，SLC5A8基因甲基化與甲狀腺腫瘤患者包膜侵犯、TG水平、膽固醇水平、甘油三酯含水平、術前甲狀腺功能、淋巴結轉移有關，差異有統計學意義(P<0.05)，而與年齡、性別、結節數量、結節大小等因素無關。隨訪發現，SLC5A8基因甲基化陽性患者術后2年復發率(25.67%)顯著高于陰性患者(10.20%)，且與疾病分級相關。COX多因素分析結果顯示，SLC5A8基因甲基化為影響甲狀腺腫瘤患者預后的危險因素之一，與王曉輝等[9]的研究結果一致。

綜上所述，通過對甲狀腺腫瘤SLC5A8基因甲基化的檢測，表明其在甲狀腺腫瘤中普遍存在，可作為診斷、識別甲狀腺腫瘤的輔助技術。同時，為進一步研究甲狀腺腫瘤的發生發展及預后的表觀遺傳學變化機制提供了重要依據，并對甲狀腺腫瘤的分子生物學治療提供潛在幫助。