3-溴丙酮酸對(duì)美國(guó)白蛾核型多角體病毒的增效作用

劉瑞霞，李恩杰，柏 超，王青華，段立清

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所/國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300；4.北京市新海園林工程有限公司，北京 100018)

美國(guó)白蛾（Hyphantria cunea(Drury)）屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是一種極易暴發(fā)成災(zāi)的世界性的檢疫害蟲，也是我國(guó)重大外來(lái)入侵害蟲。美國(guó)白蛾具有食性雜、適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖量大、危害嚴(yán)重，傳播速度快等特點(diǎn)[1-2]，2019年被國(guó)家林業(yè)和草原局列為二級(jí)危害性林業(yè)有害生物（國(guó)家林業(yè)和草原局公告2019年第20號(hào)）。美國(guó)白蛾于1979年首次在我國(guó)遼寧丹東地區(qū)發(fā)現(xiàn)，此后由東向西擴(kuò)散，到2019年疫區(qū)已經(jīng)擴(kuò)散至北京、河北、內(nèi)蒙古、河南、江蘇和安徽等13個(gè)省（區(qū)、市）的598個(gè)縣級(jí)行政區(qū)[3]；到2020年，發(fā)生面積已達(dá)74.64萬(wàn)hm2，擴(kuò)散范圍進(jìn)一步加大，僅疫區(qū)就新增11個(gè)[4-5]；2021年疫區(qū)已涉及13個(gè)省（區(qū)、市）的607個(gè)縣級(jí)行政區(qū)（國(guó)家林業(yè)和草原局公告2021年第7號(hào)）。據(jù)預(yù)測(cè)分析，隨著氣候變化，美國(guó)白蛾潛在生境整體向中國(guó)北部和內(nèi)陸濕度較高地區(qū)偏移，黑龍江、四川、山西、臺(tái)灣等地區(qū)未來(lái)可能成為美國(guó)白蛾主要潛在的發(fā)生區(qū)域[6]。為了減少美國(guó)白蛾的危害，人們研究了多種防治藥劑，其中化學(xué)農(nóng)藥因具有易加工、高效殺死大量個(gè)體等特點(diǎn)而在美國(guó)白蛾防治中發(fā)揮了重要作用，但其所帶來(lái)的負(fù)面影響，如環(huán)境污染，易產(chǎn)生藥害、抗藥性、殺傷天敵、破壞生態(tài)系統(tǒng)等問題，促使人們偏向開發(fā)和利用安全、高效、可持續(xù)的生物防治藥劑。

美國(guó)白蛾核型多角體病毒（Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HycuNPV）具有毒力強(qiáng)，對(duì)寄主專一，對(duì)環(huán)境和人畜安全，不殺傷天敵等優(yōu)點(diǎn)，成為美國(guó)白蛾生物防治中重要的一種病原微生物殺蟲劑[7]。但其自身也有一定的缺陷，如病毒的大量復(fù)制只能通過活體繁殖，生產(chǎn)成本和防治成本較化學(xué)農(nóng)藥均相對(duì)較高；另外，病毒侵染害蟲到致病通常需要一定的周期，在該周期內(nèi)，病蟲的取食量幾乎不減少，仍會(huì)對(duì)農(nóng)林作物造成一定的損失[8-9]，這些因素制約了HycuNPV殺蟲劑的發(fā)展。因此，研究和開發(fā)能夠提高HycuNPV的殺蟲效率、縮短殺蟲時(shí)間的增效劑資源，成為擴(kuò)大該病毒殺蟲劑推廣應(yīng)用的重要途徑[10-12]。

3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BrPA）既是殺菌劑噻菌靈的中間體，也是糖酵解產(chǎn)物中丙酮酸的類似物，對(duì)糖酵解途徑的限制酶——己糖激酶（hexokinase II，HKII）的活性具有抑制作用[13]。已有研究表明，3-BrPA在醫(yī)學(xué)上可用于抑制腫瘤細(xì)胞ATP的產(chǎn)生[14-15]，并會(huì)抑制真菌的繁殖[16]，被稱為是一種新型、高效、無(wú)污染的生物制劑[17-18]。在病蟲害防治方面，高劑量的3-BrPA對(duì)秀麗隱桿線蟲具有毒性，低劑量的3-BrPA會(huì)延長(zhǎng)線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間[18-19]；此外，3-BrPA對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育也具有顯著的抑制作用[20]。為此，本研究利用3-BrPA作為HycuNPV的生物增效劑，探討3-BrPA對(duì)HycuNPV的毒力影響和對(duì)美國(guó)白蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響。以期利用3-BrPA作為HycuNPV的增效劑提高病毒對(duì)美國(guó)白蛾的殺蟲效果，為HycuNPV殺蟲劑的廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美國(guó)白蛾核型多角體病毒（HycuNPV）、美國(guó)白蛾3齡幼蟲和人工飼料均由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)昆蟲病毒研發(fā)中心提供，3齡幼蟲于溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，光周期16L∶8D的昆蟲飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)。3-BrPA（純度≥95%）購(gòu)自北京愛博森生物試劑有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 3-BrPA對(duì)HycuNPV的增效作用的測(cè)定 美國(guó)白蛾3齡幼蟲置于養(yǎng)蟲杯（Φ6.3 cm×5.2 cm）饑餓處理24 h。3-BrPA添加劑量分別為5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mg·g-1時(shí)；純 化的HycuNPV懸浮液依次稀釋為3.0×107、9.0×106、3.0×106、9.0×105和3.0×105OBs·mL-1。將上述3-BrPA與HycuNPV混合加至養(yǎng)蟲杯，混合的加入方法具體如下：先將3-BrPA加入每杯含有（20±0.5）g的人工飼料表面，待滲入飼料后，再將HycuNPV懸浮液加入，自然晾干，接入試蟲，并設(shè)置無(wú)菌水為對(duì)照組。每組選取健康幼蟲10頭，重復(fù)3次。自接毒后第3 d開始每天記錄美國(guó)白蛾幼蟲死亡癥狀和死亡數(shù)，直至蟲體全部死亡或化蛹[21-22]。

1.2.2 3齡幼蟲發(fā)育歷期、羽化率和化蛹率的測(cè)定 選取濃度為9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV，并分別添加劑量為5.0、10.0、12.5和15.0 mg·g-1的3-BrPA對(duì)美國(guó)白蛾3齡幼蟲進(jìn)行接毒，分析不同處理對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲的發(fā)育歷期、化蛹率和羽化率的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2021處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn) 行probit分 析，分 別 求 出3-BrPA對(duì)HycuNPV的致死中濃度（LC50）和致死中時(shí)間（LT50），并用單因素方差分析（ANOVA），Tukey test（P＜0.05）分析幼蟲發(fā)育歷期、化蛹率和羽化率等[23]。

1.3.1 增效倍數(shù)與共毒系數(shù) 增效作用采用增效倍數(shù)（SR）與共毒系數(shù)（CTC）來(lái)衡量[11]，計(jì)算公式如下：

上式（1）中SR的計(jì)算和評(píng)價(jià)參考劉海明與段彥麗等人的方法[11、24]，增效倍數(shù)（SR）＞0，表示為增效作用；（SR）＜0，表示為拮抗作用；（SR）=0，表示為無(wú)增效作用。

上式（2）根據(jù)復(fù)配劑的聯(lián)合作用劃分標(biāo)準(zhǔn)，共毒系數(shù)（CTC）≥120，則藥劑復(fù)配表示為增效作用；若CTC≤80，則表示拮抗作用；若80＜CTC＜120，則表示為相加作用[25-26]。

2 結(jié)果分析

2.1 不同處理對(duì)美國(guó)白蛾3齡幼蟲的LC50和增效作用分析

由表1可知，HycuNPV懸浮液在不同劑量的3-BrPA作用下，其毒力出現(xiàn)顯著差異。當(dāng)3-BrPA的添加劑量為0時(shí)，僅含有HycuNPV的對(duì)照組LC50為4.362×105OB·mL-1；當(dāng)3-BrPA的添加劑量低于15.0 mg·g-1時(shí)，HycuNPV的LC50均低于 對(duì) 照 組 的LC50；添 加15.0 mg·g-13-BrPA的HycuNPV與對(duì)照組相比，LC50并沒有顯著的差異。也就是說(shuō)，隨著添加3-BrPA的劑量降低，LC50差異逐步增大。同時(shí)根據(jù)增效作用計(jì)算可知，當(dāng)3-BrPA的添加劑量分別為5.0、10.0和15.0 mg·g-1時(shí)，增效倍數(shù)（SR）分別為825.14、164.72和0.47，共毒系數(shù)（CTC）分別為82 613.63、16 579.25和147.27。由此可見，添加5.0和10.0 mg·g-1的3-BrPA對(duì)HycuNPV具有明顯的增效作用，且前者的增效作用最顯著。

表1 不同處理對(duì)美國(guó)白蛾3齡幼蟲的LC50和增效作用分析Table 1 Analysis of LC50 and synergistic effects of different treatments on the 3rd instar larvae of H.cunea

2.2 不同處理對(duì)美國(guó)白蛾3齡幼蟲的LT50分析

不同濃度的HycuNPV懸浮液在不同劑量的3-BrPA作用下的殺蟲速度如表2所示。不同濃度的HycuNPV在不同劑量的3-BrPA作用下，其殺蟲效果各不相同。在濃度為3.0×107OBs·mL-1的HycuNPV中添加5.0 mg·g-1的3-BrPA，LT50最短（3.112 d），添加10.0 mg·g-1的3-BrPA次之（3.710 d）；在 濃 度 為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV中添加5.0 mg·g-1的3-BrPA，LT50縮短時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)9.724 d。

表2 不同處理對(duì)美國(guó)白蛾3齡幼蟲的LT50分析Table 2 Analysis of LT50 of different treatments on the 3rd instar larvae of H.cunea

當(dāng)HycuNPV濃度為3.0×107和3.0×106OBs·mL-1時(shí)，添加15.0 mg·g-1的3-BrPA會(huì)使LT50延 長(zhǎng)；添 加5.0 mg·g-1的3-BrPA會(huì) 縮短LT50，相比較對(duì)照，分別縮短4.628 d和6.376 d。當(dāng)HycuNPV濃度為9.0×106OBs·mL-1時(shí)，添加3-BrPA均會(huì)使LT50延長(zhǎng)。當(dāng)HycuNPV濃度為9.0×105和3.0×105OBs·mL-1時(shí)，添加3-BrPA均可使LT50明顯縮短，且隨著3-BrPA添加劑量的降低，LT50的差異逐步增大。

當(dāng)3-BrPA的添加劑量為5.0 mg·g-1時(shí)，僅有濃度為9.0×106OBs·mL-1的HycuNPV的LT50延長(zhǎng)了，其余濃度的HycuNPV的LT50均明顯縮短，其中濃度為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50縮短時(shí)間最長(zhǎng)（9.724 d）。當(dāng)3-BrPA的添加劑量為10.0 mg·g-1時(shí)，濃度為3.0×107、9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50縮短了，且濃度 為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50縮短時(shí)間（7.070 d）明顯長(zhǎng)于其余2個(gè)濃度(4.030 d和3.280 d)。當(dāng)3-BrPA的添加劑量為15.0 mg·g-1時(shí)，僅有濃度為9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50出現(xiàn)縮短。

綜上所述，在一定濃度的HycuNPV中加入低劑量的3-BrPA，會(huì)顯著提高病毒的殺蟲速度。

2.3 不同處理對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲發(fā)育歷期的影響

由表3可以看出，不同濃度的HycuNPV懸浮液在不同劑量的3-BrPA作用下，美國(guó)白蛾幼蟲的3齡發(fā)育歷期和總發(fā)育歷期（3齡起）都得到延長(zhǎng)。當(dāng)3-BrPA的添加劑量一定時(shí)，濃度為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美國(guó)白蛾幼蟲3齡發(fā)育歷期的延長(zhǎng)時(shí)間都長(zhǎng)于濃度為3.0×105OBs·mL-1；濃度為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美國(guó)白蛾幼蟲總發(fā)育歷期的延長(zhǎng)時(shí)間與濃度為3.0×105OBs·mL-1的幾乎無(wú)差異。特別是當(dāng)3-BrPA的添加劑量為15.0 mg·g-1時(shí)，濃度為9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美國(guó)白蛾幼蟲一直未化蛹。

表3 不同處理對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲發(fā)育歷期的影響Table 3 Effects of different treatments on the larvae development duration of H.cunea

當(dāng)HycuNPV濃度一定時(shí)，隨著3-BrPA添加劑量的升高，美國(guó)白蛾幼蟲的3齡發(fā)育歷期和總發(fā)育歷期均逐步變長(zhǎng)，其中，在HycuNPV濃度為9.0×105OBs·mL-1時(shí)，添加劑量為15.0 mg·g-1的3-BrPA后，美國(guó)白蛾幼蟲3齡發(fā)育歷期最長(zhǎng)，較對(duì)照組延長(zhǎng)時(shí)間高達(dá)9.00 d。

2.4 不同處理對(duì)幼蟲總存活率、化蛹率和羽化率的影響

在不同濃度的HycuNPV中添加不同劑量的3-BrPA，感染美國(guó)白蛾3齡幼蟲后的總存活率、化蛹率和羽化率如表4所示。當(dāng)HycuNPV的濃度為3.0×105OBs·mL-1，僅在3-BrPA劑量為12.5 mg·g-1時(shí)，美國(guó)白蛾幼蟲總存活率為10.00%，化蛹率和羽化率均為33.33%；在3-BrPA其余的添加劑量下，美國(guó)白蛾幼蟲總存活率都為0，無(wú)化蛹，也無(wú)羽化。當(dāng)HycuNPV的濃度為9.0×105OBs·mL-1時(shí)，隨著3-BrPA添加劑量的降低，美國(guó)白蛾幼蟲總存活率逐漸下降，最高為30.00%，最低為13.33%；3-BrPA添加劑量為5.0、10.0和12.5 mg·g-1時(shí)，美國(guó)白蛾幼蟲的化蛹率分別為66.67%、25.00%和44.44%，羽化率分別為22.22%、33.33%和9.52%。

表4 不同處理對(duì)幼蟲總存活率、化蛹率和羽化率的影響Table 4 Effects of different treatments on the overall survival rate,pupation rate and emergence rate of larvae

當(dāng)3-BrPA的添加劑量一致時(shí)，濃度為3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美國(guó)白蛾幼蟲總存活率、化蛹率和羽化率均低于濃度為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV。

3 討論

3-BrPA為低毒性殺菌劑，安全性高，對(duì)環(huán)境無(wú)害，有望作為一種理想的昆蟲病毒增效劑。已有研究表明，高劑量的3-BrPA對(duì)線蟲和美國(guó)白蛾有毒性作用，且低劑量的3-BrPA可使線蟲生長(zhǎng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)，美國(guó)白蛾的生長(zhǎng)發(fā)育抑制[18-20]；但是，都未將3-BrPA作為增效劑與其他生物殺蟲劑聯(lián)合使用。本研究發(fā)現(xiàn)3-BrPA能夠與HycuNPV聯(lián)合作用，既提高了HycuNPV的毒力和殺蟲速度，又表現(xiàn)出顯著的增效作用（表1，2）。當(dāng)添加3-BrPA的劑量降低時(shí)，對(duì)HycuNPV的增效倍數(shù)（SR）和共毒系數(shù)（CTC）越顯著，其中3-BrPA為5.0 mg·g-1時(shí)，SR和CTC的值最大。當(dāng)3-BrPA的添加劑量為5.0 mg·g-1時(shí)，僅有濃度為9.0×106OBs·mL-1的HycuNPV的LT50延長(zhǎng)了，其余濃度的LT50均明顯縮短。其中濃度為9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50縮短時(shí)間最長(zhǎng)。根據(jù)SR、CTC、LC50與LT50綜合決定，兩者聯(lián)合的最佳增效配比為：9.0×105OBs·mL-1HycuNPV+5.0 mg·g-13-BrPA。

更為重要的是，3-BrPA的添加，使HycuNPV對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的抑制作用（表3）。而HycuNPV單劑作用速度慢，即便害蟲最終因感染病毒而死，可害蟲在感染病毒后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育速度正常，其對(duì)寄主的取食量并未減少，當(dāng)代害蟲依然對(duì)農(nóng)林作物造成了嚴(yán)重的危害[27]。因此HycuNPV和3-BrPA的聯(lián)合應(yīng)用不僅保證了病毒本身控制作用的發(fā)揮，也彌補(bǔ)了其病毒本身的缺陷，從而有效抑制了該害蟲對(duì)農(nóng)林作物的危害程度，進(jìn)而達(dá)到減少防治成本和農(nóng)林作物經(jīng)濟(jì)損失的目的。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，3-BrPA與HycuNPV聯(lián)合作用對(duì)化蛹率和羽化率有一定的影響（表4），加入3-BrPA后化蛹率與羽化率均低于單獨(dú)飼喂HycuNPV。同單獨(dú)應(yīng)用HycuNPV防治美國(guó)白蛾幼蟲相比，3-BrPA顯示出了其作為昆蟲病毒增效劑的諸多優(yōu)越性，可見，3-BrPA有望成為病毒增效劑的理想因子。

4 結(jié)論

3-BrPA的添加對(duì)HycuNPV具有增效作用，為HycuNPV提供新的具有應(yīng)用前景的增效劑資源。