篩胸梳爪叩甲幼蟲對竹筍揮發物及CO2的行為反應

張 威，滕 瑩，黃徐駿，李志紅，張亞波，舒金平＊，王浩杰

(1.中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省杭州市富陽區農業農村局，浙江 杭州 311400；3.浙江省遂昌縣妙高林業工作中心站，浙江 遂昌 323300)

“覓食”是生物生存與繁衍的基礎，是生物間食物鏈的關鍵一環，也是生物學及進化生態學的核心內容[1-2]。而植物揮發物（VOCs）在寄主植物-植食性昆蟲-天敵三級營養鏈連接中發揮著至關重要的作用，是植食性昆蟲及天敵昆蟲搜尋和定位寄主的重要信號物質[3-6]。據統計，在植食性昆蟲與寄主互作研究中，超98%的報道是以地面昆蟲（多以成蟲為主）為對象，對于地下昆蟲的關注較少[7-8]。相對于地面昆蟲而言，在黑暗（視覺刺激缺失）、復雜的土壤環境中昆蟲如何定位到寄主植物知之不多[9-11]。自Doane等[12]首次證實馬鈴薯叩甲（Ctenicera destructor(Brown)）幼蟲依靠植物根系釋放的CO2定位寄主以來，胡蘿卜根實蠅（Psila rosaeF.）、玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgiferaLeconte）及大栗鰓金龜（Melolontha hippocastaniFabricius）幼 蟲等多種地下昆蟲被證實對CO2有顯著的正趨向性[9,13]，CO2一度被認為是地下植食性昆蟲定位寄主的唯一信號物質[14-15]。

隨著研究的深入，發現相比于CO2，根部釋放的揮發物對土壤植食性昆蟲定位寄主更有效[11,16-17]，如大麥（Hordeum vulgareL.）根系釋放的hexanal、(E)-hex-2-enal及(E)-non-2-enal等4種揮發物能顯著激發金針蟲（鞘翅目（Coleoptera）叩甲科（Elateridae）昆蟲幼蟲的統稱）的定向移動[11]。植物根系揮發物在地下植食性昆蟲寄主搜尋過程中發揮著重要作用，但研究報道并不多。篩胸梳爪叩甲（Melanotus cribricollis(Faldermann)）是我國南方竹林金針蟲的優勢種[18]，主要蛀食雷竹（Phyllostachys violascens(Carriere) Riviere &C.Riviere）、毛 竹（Ph. edulis(Carriere) J.Houzeau）及烏哺雞竹（Ph. vivaxsMcClure）等多種筍用竹種，造成鮮筍腐爛和退筍，部分林分鮮筍受害率超70%，留養的種筍受害率高達100%，嚴重影響竹筍的產量和質量，威脅竹筍產業的健康發展[19]。前期研究表明，與普通小麥（Triticum aestivumL.）、玉米（Zea maysL.）等禾本科（Poaceae）作物相比，篩胸梳爪叩甲幼蟲偏好取食雷竹筍，竹筍特有的揮發物可能發揮了重要作用[20]，但竹筍揮發物的組成及與CO2的引誘活性差異尚未明確。本研究監測比較雷竹筍揮發物和CO2釋放劑對篩胸梳爪叩甲幼蟲的引誘作用，并鑒定了竹筍揮發物組分，旨在探索竹林金針蟲的寄主定位及識別機制，為竹林金針蟲的高效監測及防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲、竹筍和CO2釋放劑顆粒

2020年3—4月，在浙江省德清縣雷竹種植區（120°04′12″ E，30°32′08″ N）采集篩胸梳爪叩甲幼蟲，帶回至中國林科院亞熱帶林業研究所恒溫養蟲室內飼養（養蟲室溫度20±1 ℃，相對濕度60% ± 10%）。飼養時，將采集的金針蟲用無菌水沖洗數次后，依據個體大小分裝于養蟲箱中（42 cm×28 cm×22 cm），單箱飼養50頭，養蟲箱中的無菌土濕度控制在10%±1%，于黑暗條件下飼養，以鮮筍喂食（定期更換）。試驗時選取個體大小相近、齡期一致、健康活躍的幼蟲個體供試[21]。

本研究所選用的竹筍為雷竹筍，均采自浙江省杭州市富陽區永昌鎮雷竹種植區。試驗當天，在雷竹林挖掘新鮮健康竹筍（筍尖出土＜2 cm）1 000 g，保鮮帶回實驗室供試。CO2釋放劑顆粒由加拿大農業與食品研究中心Todd Kabaluk教授贈送，主要成分為酵母（Saccharomyces cerevisiaeReess ex Hansen）、小麥淀粉和藻酸鈣[22]。

1.2 雙向選擇儀

雙向選擇儀用實木材料（杉木）制成，由中心蟲室B（10 cm×5 cm×10 cm）和左右兩側2個大小相同的選擇室A和C（15 cm×10 cm×10 cm）所構成（圖1）。中心蟲室兩側隔板（10 cm×10 cm×0.1 cm）能手動拔除，使蟲室和選擇室連通，金針蟲可自由移動。實驗結束時再插入隔板，使中心蟲室和選擇室分離，便于統計不同選擇端的金針蟲數量。中心蟲室用于放置供試金針蟲，左右兩側選擇室用于放置竹筍或CO2釋放劑顆粒。篩胸梳爪叩甲幼蟲在雙向選擇儀中可自由移動，空白試驗（兩側均為無菌土）及同食物誘餌（等量竹筍）預實驗測定結果表明，自制雙向選擇儀對金針蟲的選擇行為無顯著影響（GP=0.06，P＞0.05；GH=17.71，P=0.54，G檢驗，其中GP指每個處理組合中所有重復選擇蟲數總量的G值；GH指重復之間異質性G值，下同）。

圖1 雙向選擇儀Fig.1 Dual-choice olfactometer for wireworms attraction

1.3 篩胸梳爪叩甲幼蟲監測

1.3.1 篩胸梳爪叩甲幼蟲對竹筍的行為反應 將1.75 kg含水量為10%的無菌土加入到雙向選擇儀內，水平震蕩木盒，使盒內土面平整，各部分土壤質地均勻一致，插入分隔板，備用。將新鮮雷竹筍（林地土壤以下的部分）的中間部分切成若干段，分別稱取10、20和40 g，作為3個處理，隨機埋入雙向選擇儀的任意一側選擇室的中心，另一側選擇室作空白對照（不放置竹筍）。同時，在中心蟲室的無菌土中放入10頭金針蟲（饑餓24 h，下同），并取出分隔板。24 h后，插入分隔板。首先取出中心蟲室的無菌土，在托盤內仔細分離統計其內金針蟲的數量（標記為“未作出選擇”），然后依次統計兩側選擇室內金針蟲的數量。

上述試驗均在黑暗條件下進行（室內溫度25±1 ℃，相對濕度80%±10%），每個處理共計20個重復。

1.3.2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對CO2的行為反應 取CO2釋放劑顆粒10粒（2 g）、20粒（4 g）和40粒（8 g），隨機埋入雙向選擇儀的一側選擇室的中心，另一側作為對照。同時，將10頭金針蟲在中心蟲室的無菌土內釋放，并取出隔板。24 h后統計各區域金針蟲的數量。

上述試驗均在黑暗條件下進行（室內溫度25±1 ℃，相對濕度80%±10%），每個處理共計20個重復。

1.3.3 篩胸梳爪叩甲幼蟲的選擇行為 取30 g雷竹筍和20粒CO2釋放劑顆粒，分別埋入雙向選擇儀的左右兩側選擇室的中心。同時，在中心蟲室內釋放10頭金針蟲。設置24、48 h兩個處理，于24、48 h后統計各區域金針蟲數量。

上述試驗均在黑暗條件下進行（室內溫度25±1 ℃，相對濕度80%±10%），每個處理共計20個重復。

1.4 竹筍揮發物組分測定

1.4.1 揮發物收集 利用固相微萃法提取揮發物。稱取雷竹筍50 g，放入潔凈的150 mL錐形瓶內（錐形瓶使用前用95%酒精清洗，并置于烘箱中120 ℃烘120 min），用Parafilm封口，靜置于實驗臺上，平衡30 min。將活化的SPME萃取裝置（美國Supelco公司生產，100 μm PDMS萃取頭）插入錐形瓶內，推出萃取頭，使其固定在竹筍上方5 cm處，萃取時間為60 min。萃取結束后，立即將萃取頭插入GC-MS進樣口（Agilent HP 6890GC/5975B）進行解析。實驗于暗室中進行（溫度25±1 ℃，相對濕度60%～70%），每組處理3個重復。

1.4.2 氣-質聯用儀操作條件 色譜柱：HP-5MS毛細管柱（極性，柱長30 m，內徑0.32 mm，膜厚25 μm）；不分流進樣；溶劑延遲3 min；進樣口溫度250 ℃；柱溫升溫程序為：起始溫度40 ℃，維持2 min，14 ℃·min-1升至180 ℃，再以25 ℃·min-1升至260 ℃，維持7 min。以99.999%的高純氦氣作為載氣，流量1.0 mL·min-1[17]。質譜條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，電子倍增器電壓1 340 V，掃描質量范圍50～550 aum。

1.4.3 揮發物組分鑒定與分析 根據氣-質聯用儀的分析結果，比對譜庫（NIST 2015）中標準化合物的質譜峰，對不同組分進行初步的物質鑒定；然后購買標準品，用二氯甲烷稀釋成一定濃度的溶液，按照與樣品相同的升溫程序和質譜條件，在氣-質聯用儀中進樣1 μL，將標準品的保留時間、質譜圖和結構與樣品中相應峰的保留時間、質譜圖及結構進行比對，從而確定其揮發物組分。揮發物各組分的定量分析，應用峰面積百分比法（某物質峰面積/總物質峰面積×100%）計算各成分的相對含量。

1.5 數據統計分析

選擇性試驗中，對于金針蟲在不同組合和處理間（包括空白對照）的選擇偏好均采用重復適合性（Repeated Goodness-of-fit）G檢驗。不同質量竹筍間以及不同濃度CO2間的誘蟲差異分析均采用R×C列聯表卡方檢驗（Pearson卡方檢驗）。利用DPS數據處理系統V19.05（杭州睿豐信息技術有限公司）進行數據分析，采用Excel 2019、PowerPoint 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 篩胸梳爪叩甲幼蟲對不同質量竹筍的行為反應

鮮筍誘集試驗表明，雷竹鮮筍對篩胸梳爪叩甲幼蟲表現出顯著的吸引作用（表1），但不同質量的竹筍間差異不顯著（χ2=0.576，df=2，P＞0.05；圖2）。釋放金針蟲24 h后，大多數金針蟲選擇在埋有竹筍的一端，聚集在竹筍周圍或鉆入竹筍內蛀食。供試的200頭金針蟲，10 g竹筍端有128頭，占供試金針蟲的64.00%（GP=69.43，P＜0.001；GH=21.10，P=0.331；表1）；20 g竹筍端有118頭，占供試金針蟲的59.00%（GP=61.62，P＜0.001；GH=23.64，P=0.210；表1）；40 g竹筍端有136頭，占供試金針蟲的68.00%（GP=84.17，P＜0.001；GH=8.74，P=0.977；表1）。釋放金針蟲24 h后，不同處理均有20%左右的金針蟲仍停留在中心蟲室，未作出選擇的金針蟲在不同質量鮮筍處理中無顯著差異（圖2）。

圖2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對鮮筍的趨向行為Fig.2 Preference behavior of M.cribricollis larvae towards bamboo shoots in a dual-choice olfactometer

表1 篩胸梳爪叩甲幼蟲對不同質量竹筍的選擇Table 1 Choice tests of M.cribricollis larvae towards different weight bamboo shoots in a dual-choice olfactometer

2.2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對CO2的行為反應

CO2對篩胸梳爪叩甲幼蟲有顯著的吸引作用，且不同濃度的CO2對金針蟲引誘力差異顯著（χ2=7.945，df=2，P＜0.05；表2，圖3）。放入10粒CO2釋放劑顆粒時，供試的200頭金針蟲中161頭作出了選擇，CO2端有99頭，占供試金針蟲的49.50%（GP=8.58，P＜0.01；GH=9.21，P=0.970）；放入20粒CO2釋放劑顆粒時，作出選擇的有141頭，CO2端有107頭，占供試金針蟲的53.50%（GP=36.70，P＜0.001；GH=22.22，P=0.274）；放入40粒CO2釋放劑顆粒時，作出選擇的有149頭，CO2端有107頭，占供試金針蟲的53.50%（GP=29.33，P＜0.001；GH=11.82，P=0.893）。20粒CO2釋放顆粒劑對金針蟲的引誘力最強，與10粒CO2釋放顆粒劑相比有顯著差異，但與40粒CO2釋放顆粒劑間差異不顯著（圖3）。

圖3 篩胸梳爪叩甲幼蟲對不同濃度CO2的趨向行為Fig.3 Preference behavior of M.cribricollis larvae towards CO2 of different concentrations in a dual-choice olfactometer

表2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對不同濃度CO2的選擇Table 2 Choice tests of M.cribricollis larvae towards CO2 of different concentrations in a dual-choice olfactometer

2.3 篩胸梳爪叩甲幼蟲在竹筍和CO2間的選擇行為

在竹筍和CO2釋放劑顆粒之間，篩胸梳爪叩甲幼蟲顯著偏好竹筍，竹筍的吸引力強于CO2，但不同的時間處理（24 h和48 h）間差異不顯著（χ2=0.314，df=1，P＞0.05）。供試的200頭金針蟲中，24 h后竹筍端有139頭（占供試金針蟲的69.5%），CO2端有34頭（GP=68.37，P＜0.001；GH=15.40，P=0.697；表3），而48 h后，竹筍端有142頭（占供試金針蟲的71.0%），CO2端有35頭（GP=47.69，P＜0.001；GH=15.40，P=0.749；表3）。

表3 篩胸梳爪叩甲幼蟲在竹筍和CO2釋放物間的選擇Table 3 Choice tests of M.cribricollis larvae between bamboo shoots and CO2 resource in a dual-choice olfactometer

2.4 雷竹筍揮發物組分

固相微萃取法收集、鑒定雷竹筍揮發物17種，其中萜烯類化合物7種（均是倍半萜），羧酸類化合物2種，醇類、酯類及酚類化合物各1種，還有1種烷烴和1種烯烴類化合物（表4）。17種化合物中，相對含量最高的為烯烴類化合物，相對含量占比達66.62%，其次是倍半萜（27.98%），而7種倍半萜中以α-葎草烯含量最高，占16.49%（表4）。

表4 雷竹筍揮發物的成分及其相對含量Table 4 Relative content (%) and volatile components of Ph.violascens shoot collected by HS-SPME

3 討論

植物揮發物在植食性昆蟲搜尋和定位寄主過程中發揮著關鍵作用，尤其在黑暗、環境更為復雜的地下植食性昆蟲的覓食過程中更為重要[13,15,23]。大量研究表明，CO2是地下植食性昆蟲寄主定位的重要信號物質[23-24]，如0.5%的CO2對玉米根螢葉甲幼蟲有很強的引誘作用[25]，且CO2濃度能調節其遠距離寄主搜尋和定位行為[23]。本研究利用CO2釋放劑證實了篩胸梳爪叩甲幼蟲（竹林金針蟲）對土壤中的CO2表現出顯著的吸引作用，同時CO2濃度對竹林金針蟲的定向移動有顯著影響，與其它金針蟲的相關研究結果吻合[12,17]。CO2濃度與金針蟲行為密切相關，過低或過高均影響金針蟲的定向選擇，CO2濃度過低金針蟲難以探測，過高的CO2濃度對金針蟲表現出驅避或毒性作用[25-26]，研究表明，4 g CO2釋放劑顆粒的引誘效果最佳，增加CO2釋放劑的量對竹林金針蟲的趨向行為影響不顯著。

盡管CO2對金針蟲、蠐螬等地下植食性昆蟲有吸引作用，但土壤環境中CO2普遍存在且濃度多變，地下植食性昆蟲仍能快速找到寄主，有學者認為，地下植食性昆蟲在缺乏視覺輔助的情況下，擁有更為精巧的化學通訊和寄主識別機制。植物在生長過程中，根系會釋放大量的CO2和自身代謝產物（初生及次生代謝物），尤其是次生代謝物對地下昆蟲的寄主搜索和選擇行為有重要影響[11,15,27]。本研究中，在竹筍和CO2釋放劑之間，篩胸梳爪叩甲幼蟲顯著偏好竹筍，這也表明竹筍的揮發物在金針蟲寄主搜尋和定位過程中發揮重要作用。

目前對慈竹（Bambusa emeiensisL.C.Chia&H.L.Fung）、麻竹（Dendrocalamus latiflorusMunro）及綠竹（B. oldhamiiMunro）等叢生竹筍[28-29]，毛竹[30-31]和苦竹（Pleioblastus amarus(Keng) Keng f.）等散生竹筍的揮發物成分研究有過報道。竹筍揮發物組分因竹種、提取方法及提取部位的不同，揮發物組分差異顯著，呈現出一定的風味特征。本研究采用固相微萃取氣質聯用法收集鑒定了雷竹筍（地下部分）揮發物組分17種，其中以烯烴和萜烯類化合物為主。萜烯類化合物是最為常見的植物揮發性組分，在植食性昆蟲產卵及搜尋寄主過程中常發揮重要的作用[32-33]。如β-caryophyllene是玉米根螢葉甲[34]、α-葎草烯是甘薯蟻象（Cylas formicariusFabr.）[35]、α-pinene及β-pinene是鰓金龜（M. melolonthaL.）[36]等地下植食性昆蟲幼蟲定位寄主的關鍵信號物質。Barsics等研究表明，大麥根釋放的hexanal,(E)-hex-2-enal及(E)-non-2-enal等4種醛類揮發物能吸引金針蟲的定向移動[11]。本研究發現的α-葎草烯等7種相對含量較高的倍半萜，是否為篩胸梳爪叩甲幼蟲定位竹筍的關鍵物質，將在后續研究中進一步測定。

大多地下植食性昆蟲是世界性重大害蟲，危害周期長、隱蔽性強，種群動態監測及防治一直是植物保護工作的重點和難點[37]。近年來，金針蟲在浙江、福建及江西等核心竹筍產區爆發成災，造成重大經濟損失，如何綠色、經濟、有效地控制竹林金針蟲是竹筍產業健康發展中亟待解決的問題。本研究證實了竹筍揮發物及CO2對竹林金針蟲有顯著的吸引作用，并鑒定了竹筍揮發物組分，為對竹林金針蟲具有引誘活性的信號物質的篩選及基于引誘劑的金針蟲AK技術（Attract and kill strategy）研發提供了重要依據。

4 結論

研究表明，篩胸梳爪叩甲幼蟲對新鮮雷竹筍和CO2釋放劑顆粒均有顯著趨性，在竹筍和CO2釋放劑之間，篩胸梳爪叩甲幼蟲顯著偏好新鮮竹筍，相比CO2釋放劑，竹筍萌發時所釋放的揮發物對竹林金針蟲搜尋寄主更為有效。本研究分離鑒定了17種可能對篩胸梳爪叩甲幼蟲具有吸引作用的萜烯類化合物，為研發高效的金針蟲引誘劑，探索竹林金針蟲的新型防控技術奠定了基礎。