黃酮類活性物質參與制備銀納米粒子的研究進展

趙志遠,李培駿,程蕾蓉,曹興業,謝閏生,李霞

(桂林理工大學 化學與生物工程學院,廣西 桂林,541004)

納米科學和納米技術已被引入生物學、化學、物理學和生物工程的跨學科領域。近年來,納米顆粒的研究在許多科學技術領域引起了廣泛的關注,納米技術領域經歷了實質性的發展[1]。通常,納米顆粒的直徑范圍為1～100 nm。納米顆粒的物理和化學性質不同于常規材料。納米顆粒因其高比表面積和小尺寸而具有獨特的性質。納米顆粒的生物活性和表面能隨著其表面積的變化而變化[2]。

在眾多的納米技術中,由于納米銀(silver nanoparticles,AgNPs)獨特的屬性,它們被用于不同的領域,如生物醫學(快速診斷、成像、組織再生和藥物輸送,以及新醫療產品的開發)[3]、紡織業、食品包裝[4]、化妝品業、催化劑[5]、傳感器、生物學、抗菌性[6]、DNA測序[7]、表面增強拉曼反射(surface-enhanced Raman scattering,SERS),氣候變化和污染控制,清潔水技術,能源生產和信息存儲等。一般來說,AgNPs的合成采用物理化學技術,如高壓滅菌、γ射線輻射、微乳液的使用、電化學技術、化學還原、激光燒蝕、微波輻射和光化學還原進行[8-9]。上述方法產率高,但同時也存在一些局限性,如使用有毒化學品、功能成本和能源需求高。為了克服物理化學方法的局限性,替代的成本效益高的方法包括植物提取物、微生物和天然聚合物[10]。綠色化學和納米技術的結合擴大了細胞遺傳學和生物相容性金屬納米顆粒的應用范圍[11]。

黃酮類化合物是一種植物次生代謝產物,廣泛存在于食品和飲料(如水果、蔬菜、茶、可可和葡萄酒)中,并參與紫外線防護、色素沉著、抗病性和固氮刺激。重要的是,黃酮類化合物具有許多寶貴的生物功能,包括抗氧化、抗癌、抗病毒、抗炎和保肝活性。黃酮類化合物具有C15(C6—C3—C6)骨架的3個芳香環(A、B和C)排列。如圖1所示,環A為苯,并與六元環(環C)縮合,該六元環在位置2處攜帶苯(環B)作為取代基。黃酮類化合物有4 000多種,按其化學結構分為六大類:黃酮(flavones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷醇(flavanols)、黃烷酮(flavanones)、花青素(anthocyanidins),和異黃酮(isoflavones),它們可以主動螯合并將金屬離子還原為納米顆粒。黃酮不同種類的基本結構如圖1所示。

黃酮類化合物具有生物相容性、低毒性和環境友好性等優點。然而,黃酮類化合物由于吸收率低、穩定性差、不溶性、被動擴散和胃腸道主動外排,阻礙了其在體內的生物活性應用[12]。有趣的是,使用納米材料的新型藥物輸送系統具有廣泛的應用,為科學整合和創新提供了新的治療基礎。從光譜角度來看,它們可以用作制備生物相容性AgNPs的還原劑,因為黃酮屬于對金屬表面親和力相對較低的物質(它們的結構中不含硫或氮原子)。使用黃酮類化合物制備的AgNPs,可使AgNPs在食品和制藥工業中的應用大大拓寬。本篇綜述重點闡述了植物類黃酮化合物在AgNPs綠色合成中的作用,從制備方法、表征技術[紫外紫外-可見分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-Vis)、傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)、X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)、動態光散射(dy- namic light scattering,DLS)、透射電子顯微鏡(trans- mission electron microscope,TEM)和能量色散X射線能譜(energy dispersive spectroscopy,EDS)]、合成機制和應用方面等方面對其進行介紹。

圖1 黃酮化合物的基本結構[12]Fig.1 Basic structure of flavonoids compound[12]注:flaones-黃酮;flavanones-黃烷酮;flavonols-黃酮醇;flavanols-黃烷醇;isoflavones-異黃酮;anthocyanidins-花青素

1 黃酮類AgNPs的制備

一般來說,AgNPs的合成首先是將溶液狀態的黃酮與銀鹽(通常為硝酸銀)混合。混合后,溶液特定的條件下孵育。AgNPs的合成分兩步完成。第一步,是黃酮將銀鹽中的Ag+還原成Ag0;第二步是離心,去除反應中未反應的游離體,如黃酮、銀鹽等。由于黃酮類化合物的獨特的生物活性,在合成AgNPs的過程中具有還原劑和穩定劑的作用[11]。可以通過優化不同參數(溫度、pH值、時間、黃酮和硝酸銀濃度)來制備不同產量、尺寸、形狀和穩定性等性質的AgNPs。

pH值對黃酮類化合物的物理和化學性質有很大影響,這與它們的溶解度、解離度和還原能力密切相關,且對AgNPs的合成具有一定的影響[13]。堿性環境是銀離子還原反應的必要條件。堿性條件下,黃酮類化合物中羥基更容易失去H+，從而使得整個分子帶負電荷,這種帶有負電荷的黃酮類化合物不但更容易與Ag+作用,而且更容易失去電子發生還原反應。LUO等[14]研究了pH值的變化對制備的AgNPs,使用紫外可見光譜進行表征,成功制備了粒徑為12.7 nm的AgNPs;發現,當反應系統的pH值為7時,在400～450 nm處未發現明顯的吸收峰,說明在此條件下并沒有AgNPs的產生;當pH值達到8時,從350～600 nm 的吸光度顯著增加,最大吸收峰在426 nm,表明AgNPs的形成。當pH值達到10時,表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)波長向較短波長有一個小的偏移,表明粒徑減小[15]。ZHOU等[16]通過對不同pH值制備AgNPs的過程中影響研究。在pH值為10的條件下,使用槲皮素和蘆丁制備了粒徑大小為25 nm的AgNPs,所得到的結果與LUO等[14]一致。因此,在其他條件相同的情況下,pH值在10左右時,是制備AgNPs的最優pH。

通過控制AgNO3和黃酮化合物的濃度,可以達到增加AgNPs產量的目的。DENG等[17]在研究AgNO3和黃酮化合物的濃度對于制備AgNPs影響研究中發現,當AgNO3的濃度非常低時,幾乎不發生AgNPs的合成。隨著AgNO3的濃度增加,AgNPs溶液的產量逐漸增加,最大吸收強度增強。同時,RAO等[18]通過改變黃酮化合物濃度達到了類似的結果。黃酮化合物濃度過低時,反應體系中缺少還原劑,便無法還原制備出AgNPs。

據報道,反應溫度和反應時間一直是納米顆粒合成中最關鍵的因素之一。LI等[19]在研究中發現,AgNPs 的產量隨著溫度的升高而增加,較高的溫度可以促進更多AgNPs產生,這與MUNIYAPPAN等[20]的研究結果一致。在較低溫度時,如20～60 ℃,溫度對AgNPs的粒徑影響不大。但在較高溫度時,如80 ℃或90 ℃,AgNPs的粒徑和多分散性指數(polymer dispersity index,PDI)會突然增加。這種現象可能是由于AgNPs膠體在高溫下的穩定性降低,導致AgNPs的團聚和均勻性差。較高的溫度還會導致黃酮類化合物失去其部分原有的生物活性,導致所制備的Ag- NPs無法達到預期的作用。所以,在使用黃酮制備AgNPs的過程中應選取適當的溫度作為反應條件。反應時間也是影響AgNPs合成的主要因素之一[21]。BARUAH等[22]在研究反應時間對合成AgNPs影響時發現,在反應時間達到1 h時,Ag+的還原率達到最高。但綜合來看反應時間對其影響不大。

因此,綜合來看,在制備黃酮基AgNPs的過程中,反應溫度、時間、pH值、黃酮濃度和硝酸銀濃度等反應條件對AgNPs的制備都產生了不同程度的影響(表1)。但在使用不同黃酮類化合物制備AgNPs的研究中,發現這些反應條件都是對AgNPs的綜合影響,單一條件對AgNPs的影響無法呈現出相關性。因此,在使用黃酮類活性物質制備AgNPs的研究中,應做好前期制備的工藝優化。這對制備AgNPs整個實驗的質量而言,具有重要的意義。

表1 不同黃酮類化合物制備AgNPs的優化條件、表征方法及應用Table 1 Optimization conditions, characterization methods and application of AgNPs with different flavones

2 黃酮類AgNPs的表征

由于單一技術無法完全表征黃酮基AgNPs,因此可以采用多種不同的技術來表征,如UV-Vis、FTIR、XRD、SEM、DLS、TEM、EDX、XPS和Zeta電位等,來研究黃酮化合物與AgNPs的結合機制、表面形貌、粒徑、價態和晶體性質等特征。

AgNPs的初始合成主要通過UV-Vis進行分析。一般來講,不同的納米粒子在UV-Vis光譜中吸收峰的位置會不相同,例如,納米銅會在600～650 nm處有較強的吸收峰,納米金的吸收峰會處于500～600 nm處,而納米銀會在410 nm左右表現出很強的吸收峰[10]。因此,可以通過UV-Vis光譜來確定所制備的金屬納米粒子的種類。同時,對于同種樣品可以通過峰的位置及形狀判斷樣品中納米粒子的大小和形貌。在使用紫外-可見光譜分析黃酮基AgNPs時,可以發現在240～285 nm范圍內出現第一個紫外吸收峰,這歸因于黃酮類物質所含有的芳香環[12]。FTIR有助于探測銀納米粒子表面的化學成分和納米粒子上封端劑的局部分子環境。總的來說,黃酮基AgNPs的紅外光譜通常保留了黃酮類化合物的特征譜帶,并且提供了黃酮基AgNPs的結構信息[17-39]。通過光譜法來獲得黃酮類活性物質與AgNPs中化學成分組成的信息,已是很普遍的手段。諸如拉曼光譜和核磁共振等,亦可用于此類研究,但使用甚少。

SEM和TEM研究了納米顆粒的表面形貌,使用DLS[46]來測定粒子粒徑大小。在使用黃酮類物質合成納米銀后,由于黃酮具有還原劑及穩定劑的作用,可以通過電鏡來從AgNPs的表面研究其結合機制及包覆狀態。LI等[43]和AMEEN等[44]使用SEM和TEM表征楊梅素合成的AgNPs,發現其納米粒徑大小為25 nm,表面形狀為圓形顆粒。AgNPs粒子的形狀大多為球狀圓形,但也有以不規則多面體形狀存在。AgNPs粒子的形狀大多是可以通過制備方法來控制。

EDS主要是分析所制備的AgNPs的元素組成[28]。在使用EDS分析AgNPs時,EDS光譜在3 keV處顯示出強烈的峰值,表明Ag是AgNPs中的主要元素。SHIIRZADITABAR等[47]在研究中發現,在3 keV的峰值顯示出弱碳、氧和氯等。這是由于黃酮類化合物或其他黃酮提取物中的的生物分子與Ag- NPs表面結合。XPS用來揭示所制備的黃酮基Ag- NPs中的金屬銀的存在并獲得其化學組成和氧化態的信息[43]。XRD主要用于研究合成AgNP的晶體或非晶結構。測定AgNPs的XRD光譜范圍為20°～80°。一般會觀察到4個峰,將所觀察到的峰與來自粉末衍射標準聯合委員會(Joint Committee on Powder Diffraction Standards,JCPDS)或國際衍射數據中心(The International Centre for Diffraction Data,ICDD)的銀數據庫進行比較,被索引為111、200、220和311,它們與銀的面心立方(face center cubic,FCC)結構相匹配(JCPDS文件號04-0783)[43-44]。一般而言,XRD的峰寬度,一定程度上代表著AgNPs粒徑的大小。使用Debye-Scherrer方程計算合成AgNPs的平均尺寸。Zeta電位計算溶液中電場作用下移動粒子的凈電荷。其中負值表示粒子周圍的凈電荷,而不是實際的表面電荷。負電荷可能是由于生物活性化合物(如黃酮等化合物)吸附在AgNPs表面所致。AgNPs的穩定性可由Zeta電位值確定。高Zeta電位會在粒子之間產生強大的排斥力,從而阻止它們聚集。因此,AgNPs在酸性pH下顯示較低的Zeta電位值,而在更堿性的pH溶液中顯示較高的Zeta電位值。

上述表征方法已廣泛用于AgNPs的表征實驗,但是依然無法完全表述出AgNPs的生物合成奧秘。還有其他的表征方法應用在金屬納米粒子的表征中,如核磁共振、拉曼光譜、球差電鏡等,但是在黃酮基AgNPs的研究中還未曾有過使用。在研究黃酮基AgNPs的具體結合機制以及黃酮類化合物中官能團與Ag的具體結合位點中,迫切需要更先進的表征方法和儀器來揭示這一問題。

3 黃酮類AgNPs的合成機制

魏思敏等[41]研究發現,黃酮類化合物在堿性條件下更容易與Ag+反應。在堿性條件下黃酮類化合物失去羥基上的H+生成氧負離子,更容易通過靜電相互作用與AgNO3中的Ag結合,形成Ag0,如圖2所示。ANJUM等[45]在使用亞麻提取物制備Ag- NPs的研究中發現,黃酮類化合物是納米顆粒還原和穩定的主要原因。如圖3所示,ANJUM等[45]闡述了黃酮類化合物(槲皮素)通過氧化反應將Ag+還原為Ag0的機理和植物活性化合物對AgNPs起到了封蓋及穩定的作用。

目前,大多數對黃酮類化合物與AgNPs的具體結合機制依然是推測和假想。大多數現有文獻清楚地表明黃酮類化合物中的羥基和羰基在AgNPs的形成中共同起主要作用。從這一點看來,黃酮類化合物形成納米材料的效率取決于黃酮類化合物結構中羥基和羰基的數量。羥基和羰基的化學修飾可以闡明這些基團的數量和位置在納米材料形成中的重要性。

圖2 堿性條件下山茱萸水提液還原Ag+生成AgNPs的可能機制(以槲皮素為例)[41]Fig.2 Possible mechanism of Ag+ generating AgNPs under alkaline conditions (for example, quercetin)[41]

4 黃酮類AgNPs的應用

與宏觀材料相比,納米材料的物理、化學和生物特性往往表現出獨特且發生顯著變化。在各種納米粒子中,AgNPs等金屬納米粒子由于具有較大的比表面積和不同的生物活性,在生物醫學領域具有廣闊的應用前景。銀金屬歷來備受關注,并在不同領域中得到應用。AgNPs由于其在催化、生物傳感、藥物傳遞和納米器件制造等眾多領域的潛在應用,已引起人們極大的關注。銀主要用于合成納米顆粒的穩定分散體,這在攝影、催化、生物標記、光子學、光電子和SERS檢測等領域非常有用。

AgNPs作為抗菌劑,從醫療器械和家用電器的消毒到水處理都有廣泛的應用。由于Ag納米顆粒的抗菌特性,使得這些納米金屬在醫藥、各種工業、畜牧業、包裝、配件、化妝品、衛生和軍事等不同領域的應用。AgNPs對感染性微生物具有明顯的抑制作用,包括大腸桿菌、枯草桿菌、霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、梅毒斑疹傷寒和金黃色葡萄球菌。AgNPs所展示出來的良好的抑菌效果,吸引了很多研究者的注意。LI等[43]在使用二氫楊梅素制備的AgNPs抗菌研究中發現,在室溫下,其對大腸桿菌和沙門氏菌都有較好的抑制效果,最低抑菌濃度分別為1 μg/mL和100 μg/mL。JAIN等[29]使用槲皮素制備的AgNPs對大腸桿菌的最低抑菌濃度為150 μg/mL。DENG等[17]使用山奈酚制備的AgNPs對大腸桿菌的最低抑菌濃度達到了2 μg/mL。LUO等[14]在對使用百合花瓣中提取的黃酮制備的AgNPs抑菌研究中,發現其對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為31.25、62.5、250和250 μg/mL。AMEEN等[44]使用同樣的方法制備出二氫楊梅素-AgNPs,研究了其對煙曲霉、黑曲霉、福爾摩沙曲霉、白色念珠菌和副絲酵母菌等5種真菌的抗菌性,其最低抑菌濃度分別為0.83、0.73、0.67、0.95和0.89 μg/mL。通過以上使用不同黃酮類活性物質制備AgNPs的研究,可以發現,不同的黃酮基AgNPs具有不同的抑菌效果。這些初步的抑菌研究為AgNPs在抑菌領域的應用做了基礎。YOUSSEF等[48]將AgNPs加入到聚酰胺和聚苯乙烯等常用包裝材料中,所得復合材料對多種細菌具有良好抑制效果。辛宜聰等[49]將綠色合成的AgNPs與殼聚糖膜結合,制成復合材料。AgNPs在殼聚糖膜中分散良好,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑制效果。在抑菌材料這一領域,大多依然使用化學法制備AgNPs,這免不了制備的AgNPs殘留部分化學試劑。因此,使用黃酮類化合物綠色制備AgNPs將有效解決這一問題,這也為黃酮類AgNPs的后續應用研究指明了路徑。

A-亞麻中可能參與AgNPs還原和穩定的黃酮生物分子的結構;B-氧化還原反應顯示了使用槲皮素(黃酮化合物)將Ag+還原為Ag0的機理;C-黃酮化合物對AgNPs 的封蓋作用圖3 黃酮類物質制備納米銀粒子的合成機制[45]Fig.3 Synthesis mechanism of silver nanoparticles prepared from flavonoids[45]

在醫藥方面,ANWAR等[23]成功將橙皮苷負載于樹膠基AgNPs上,制備出橙皮苷負載的樹膠基AgNPs。所得復合材料具有增強藥物緩釋及抗菌作用,其主要作用為抗食腦蟲病,效果良好。RAO等[18]使用同樣的方法制備出的橙皮苷負載于樹膠基AgNPs的復合材料中,發現其還具有抗關節炎的作用。樹膠基AgNPs在整個體系中的作用為藥物輸送和藥物緩釋。WANG等[34]將異葒草苷負載于綠色制備的AgNPs上,發現所制得的復合物在體外模擬胃腸道消化中比AgNPs更穩定。此外,異葒草苷-AgNPs具有較低的紅細胞溶血率和細胞毒性,并對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶有明顯的抑制作用,為進一步開發高穩定性、低細胞毒性的AgNPs-Iso治療Ⅱ型糖尿病和肥胖提供了基礎支持。

ZHOU等[16]在研究中使用了槲皮素和蘆丁兩種黃酮類化合物制備了AgNPs,將這種黃酮基AgNPs用于絲織物的涂層材料。經AgNPs處理的絲織物對大腸桿菌的抗菌活性保持在90%以上,且30次洗滌循環后仍然使用,這種應用可作為衛生相關和醫用紡織材料。金屬基納米顆粒中,AgNPs在催化作用中起著重要作用,在許多有機轉化合成精細化學品中得到了廣泛的探索。LUO等[14]使用百合花瓣中的黃酮制備出了AgNPs。生物合成的Ag-NPs具有良好的抑菌性和穩定性以及對對硝基苯酚的硼氫化反應也表現出良好的催化活性。MUNIYAPPAN等[20]以黃檀葉為原料,在水溶液中合成了AgNPs。合成的AgNPs還可以有效地催化4-硝基苯酚(p-nitrophenol,4-NP)還原為4-氨基苯酚(4-aminophenol,4-AP)。

通過使用黃酮類化合物或植物中提取的黃酮類化合物綠色制備的AgNPs,可有效降低上述應用中有害化學物質的影響,并且可以降低其生產成本。這兩項優勢,使其研究及應用價值大大增加。

5 總結及展望

黃酮類活性物質具有獨特的結構,決定了其具有特殊的生物活性,且可有效與Ag結合。因此,黃酮類活性物質合成AgNPs得到廣泛關注。本文首先講述了黃酮類活性物質生物合成AgNPs的制備工藝,以及溫度、pH值、時間、黃酮和硝酸銀濃度等方面對AgNPs的形狀、尺寸、穩定性和產量等的影響;其次綜述了UV-vis、FTIR、XRD、SEM、DLS、TEM、EDX、XPS和Zeta電位等表征方法在黃酮類AgNPs中的應用;并描述了黃酮類AgNPs結合機制,推測在AgNPs的合成中只涉及到黃酮類化合物部分官能團,如羥基和羰基在AgNPs的形成中起主要作用;最后介紹了黃酮類AgNPs在醫藥和抗菌領域的應用。這些初步發現為更全面的黃酮類AgNPs研究鋪平了道路,以確定哪些類型的黃酮化合物參與了AgNPs的合成,以及可能影響AgNPs形成的因素。黃酮類化合物不僅為生物合成AgNPs提供了新思路,而且拓展了AgNPs的商業化應用的領域。

總的來說,雖然黃酮類AgNPs的研究盡管已經取得了重大進展,但隨著納米科學領域的發展,仍然可以預期會有很多新的研究進展方向:(1)AgNPs醫學和工業中的廣泛應用,但是對人類健康的相關潛在風險,比如誘導細胞毒性、氧化應激、活性氧、DNA損傷和細胞死亡,因此迫切需要開展毒理學及其機理方面的研究。(2)目前對黃酮類活性物質制備AgNPs的研究較多,但其具體結合位點依然不得而知,這樣的確切機制仍有待探索。(3)黃酮類活性物質擁有多種生物功能,廣泛用于藥物研究。但是作為藥物緩釋材料領域中研究依然不足。(4)目前對單分子納米金屬材料研究甚廣,尤其是銀納米材料。但對于雙金屬合金納米材料或多金屬合金納米材料,其效能能否比普通單金屬納米材料更具優勢,尚值得研究。