廣譜性抗體的制備及其在食品安全快速檢測中的應用進展

張開惠,劉源,崔艷,吳昊芬,徐永俊,馬子煜,季艷偉

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院,陜西 楊凌,712100)

食品安全仍是當今世界范圍內的首要問題之一,世界衛生組織指出,多種疾病和失調均與食品安全有關,食品安全已被世界衛生組織列為高度優先事項[1],因此,建立保障食品安全的檢測體系顯得尤為重要。目前,常用的儀器分析方法如高效液相色譜法、氣相色譜法、質譜法等,雖然具有特異性強、準確度高等特點,但往往需要繁瑣的前處理步驟和檢測過程、昂貴的儀器設備、專業化的技術人員及較長的檢測周期,不適用于快速篩查和現場檢測[2-3]。基于抗原抗體特異性反應的免疫學檢測方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低、易于商業化生產且可實現現場即時檢測等優點,在食品安全快速檢測中已得到了廣泛應用[4-5]。

目前,常用的免疫學檢測方法如酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫層析檢測法,多采用針對一種靶分子的單克隆抗體進行特異性檢測(圖1-A),但由于食品成分復雜,食品中往往含有多種結構類似的危害物,如生物毒素、農獸藥殘留及非法添加物等。當多種同類危害物共存時,由于危害物間毒性機理相似,即使單個危害物不超標,食品仍存在很大的毒性積累風險[6],而針對多種危害物的同時檢測方法既能提供更加豐富的樣品信息從而降低假陰性結果,又能減少檢測時間和成本,因此已經被廣泛應用于食品安全快速檢測領域[7]。目前,針對多種危害物的同時檢測方法多采用不同信號標記材料對多個不同抗體分別進行標記,或者僅用一種標記材料,通過將多個不同抗體分別固定在不同區域,一次加樣檢測,獲得多種被分析物的信號(圖1-B)。然而,“并聯式”檢測區域設計及制備的復雜性隨著檢測區域數量的增加而增加,并且樣品溶液在通過多個檢測區域時流量變化的不確定性將影響其檢測的準確性[8]。還有文獻報道采用多克隆抗體實現多種危害物的同時檢測,雖然多克隆抗體易制備、生產成本低,但其組分不單一、特異性較低、批次間差異較大的特點導致基于多克隆抗體的檢測方法不穩定,較難滿足市場需求。相比于多克隆抗體,廣譜性抗體基于一類或幾類物質的共有結構而實現對這一類或幾類物質的廣譜性識別[9]。相較于“并聯式”檢測方法,基于廣譜性抗體的多危害物檢測方法憑借“以一代多”的特點使其具有更低的成本和更高的檢測效力,在大批量樣品的初步、快速篩查中具有重要意義(圖1-C)。

本文主要綜述廣譜性抗體的制備方法,提高廣譜性抗體的廣譜性及親和力的常用策略,以及其在毒素類、農獸藥類殘留和其他常見食品危害物檢測中的應用現狀。

A-單一危害物的免疫層析檢測法;B-針對多種危害物的多重免疫層析法;C-基于可識別4種危害物的廣譜性抗體的免疫層析檢測法圖1 基于免疫層析檢測法檢測樣品中的4種危害物Fig.1 Detection of four kinds of hazards in samples based on immunochromatography

1 廣譜性抗體的制備方法

廣譜性抗體是廣譜性免疫學檢測方法的核心識別元件,抗原的設計及合成是制備廣譜性抗體的關鍵步驟。抗原設計和合成的方法主要有以下3種:混合抗原法、多重抗原法及基于共同抗原表位的通用型結構抗原法,除此之外,還可以通過基因突變等基因工程手段進一步提高抗體的廣譜性和親和力。

1.1 混合抗原法

混合抗原指多種抗原的混合物組成的免疫原,來自不同免疫原的多種抗原表位有利于刺激更多樣的B細胞的增殖從而增加在單細胞融合時產生各種雜交瘤細胞系的機會,為廣譜性抗體的產生和篩選奠定了基礎。混合抗原法一般是指以混合抗原作為免疫原進行免疫后,采集小鼠血清進行效價測定,選擇產生高效價血清的小鼠,分離其脾細胞用于后續的細胞融合和篩選工作,利用間接ELISA篩選廣譜性單克隆抗體(圖2),將對應的雜交瘤細胞腹腔注射到小鼠體內,大量生產目標廣譜性單克隆抗體。除產生廣譜性抗體之外,混合抗原法還能產生對單個抗原特異性更高的單克隆抗體,可以同時滿足對這2種抗體的需求。

混合抗原法已經應用于較多的領域。LIU等[10]采用氟喹諾酮類藥物的6種人工合成抗原的混合物作為免疫原(每種免疫原0.5 mg),篩選得到一株廣譜性單克隆抗體,該株抗體除不識別氟甲喹外,針對其他5種免疫原的IC50分別為0.1～132.28 ng/mL。DONG等[11]采用7種蘇云金桿菌Cry1類毒素的混合物(每種毒素各70 μg)作為免疫原進行免疫后,采用間接ELISA篩選得到一株能識別7種Cry1毒素的廣譜性抗體,采用雙抗夾心ELISA法進行測定,其針對7種毒素的檢出限在6.37～11.35 ng/mL。PENG等[12]通過在諾氟沙星和沙氟沙星的哌嗪環上引入6-溴己酸,使抗原抗體相互作用的關鍵表位即 3位羧基和1位烷基充分暴露制得諾氟沙星衍生物和沙氟沙星衍生物,以衍生物的混合物作為半抗原,最終免疫制得了能識別32種(氟)喹諾酮類抗生素的廣譜性抗體。

采用混合抗原法制備廣譜性抗體具有簡單高效的特點,但存在一些問題,如混合抗原中每種抗原的免疫原性不同,優勢抗原往往產生高親和力的抗體,而免疫原性弱的抗原產生的抗體親和力較低或丟失[13]。

圖2 采用混合抗原免疫動物后制備廣譜性單克隆抗體Fig.2 Preparation of broad-spectrum monoclonal antibodies by immunizing animals with mixed antigens

1.2 多重抗原法

多重抗原是指幾種半抗原與單個蛋白質載體分子偶聯所得的免疫原,因此也被稱為多抗原表位抗原。多重抗原法將選擇共有結構的過程“設計”到抗原抗體特異識別的免疫過程中,通過多個抗原決定簇的篩選作用得到廣譜性抗體(圖3)。相較于在半抗原設計過程中尋找“共性”的通用型結構抗原,通過控制與載體蛋白結合的半抗原的種類,可以確定誘導所產生抗體的識別譜,如果結合通用型半抗原技術,則能進一步拓寬抗體的識別譜,可以滿足對不同危害物和特殊產品的檢測需求。WANG等[14]將4種不同農藥的半抗原偶聯至牛血清白蛋白制備多重抗原,篩選得到的抗體對4種農藥半抗原的IC50分別為 0.29、0.07、0.58和2.82 μg/mL。ZHANG等[15]以對硫磷半抗原和吡蟲啉半抗原分別與牛血清白蛋白偶聯制備多抗原表位免疫原,建立了一種基于廣譜多克隆抗體的異源間接競爭酶聯免疫吸附檢測法,用于對硫磷和吡蟲啉的檢測。

制備多半抗原免疫原時,較難控制不同半抗原與載體蛋白的偶聯比,導致產生的抗體對不同分析物的親和力不一致且較低。雖然高劑量的免疫原在一定程度上有利于拓寬抗體的識別譜[16],但廣譜性抗體的親和力也會隨著多半抗原免疫原中半抗原數量的增加而降低,很可能是因為多半抗原免疫原的表面不利于淋巴細胞對載體蛋白的識別,導致免疫系統誘導不良[17]。因此,目前仍無法獲得具有同等效力且親和力較高的最佳多重免疫原。

圖3 采用多半抗原免疫原制備廣譜性抗體Fig.3 Preparation of broad-spectrum antibodies with multi-hapten immunogens

1.3 基于共同抗原表位的通用型結構抗原法

同一類污染物如農獸藥殘留和真菌毒素,具有相同的母體結構。采用結構類似物的母體結構進行半抗原的設計,并制備完全抗原,免疫動物后所得到的抗體往往可以同時識別多種具有免疫原母體結構的危害物。通用型結構抗原的設計合成一般包括半抗原的設計、半抗原與載體蛋白偶聯成完整抗原及免疫產生抗體三步。選擇合適的半抗原是制備廣譜性抗體和開發廣譜性免疫分析方法的關鍵步驟,而結構相似性是選擇半抗原的基礎[18],因此,以某些結構類似物共有的“中心基團”為分子模板,結合分子大小、立體化學、電子特性、活性基團、活性位點等指標設計半抗原是較為常用的方式。小分子污染物通過肟化活潑酯法、氨甲基化法、混合酸酐法、環氧化物法、半縮醛法、烯醇醚衍生物法與載體蛋白偶聯得到完全抗原后通過免疫、細胞融合及篩選即可得到相應的廣譜性抗體[19]。MARI等[20]通過對硝呋喃嗪代謝物進行分子改造合成半抗原,通過偶聯載體蛋白得到完全抗原,免疫后最終獲得能識別 4 種雞體內4-羥基苯肼的廣譜單克隆抗體。

隨著計算科學、量子化學、分子動力學等學科理論的發展,以及分子模擬技術、計算機輔助技術、網絡數據庫分析技術等的進步,建模式半抗原的制備也逐漸成為研究熱點,通過數據庫檢索氨基酸序列、相關軟件比較確定高度相似序列,進而通過專業網站建模、評估,找出某些結構類似物的重疊區域,即為所需要的目標序列,表達純化后即可得到相應的“人工”半抗原。如DONG等[21]從GenBank中檢索出7種主要的蘇云金桿菌Cry1類毒素：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1E和Cry1F的氨基酸序列,利用DNAMAN軟件進行比較,確定高度相似的序列,利用DNA Star軟件計算抗原表位的抗原性和親水性,將Cry1Aa和Cry1Ac的X射線晶體結構作為模型,由SWISS-MODEL網站建模,并通過Ra machadran plot、ERRAT和Verify 3D進行評估,然后用SWISS-Pdb Viewer 4.1.0軟件對模型進行分析,找出7種Cry1毒素的重疊區域。綜合考慮這些分析結果,確定了序列和空間構象相似性高、抗原性和親水性強的目標序列,并合成多肽。以合成的多肽作為半抗原,最終制備了一種能同時識別7種主要Cry1類毒素的單克隆抗體,且具有較好的親和力(1.36×10-8～5.17×10-8mol/L)(圖4)。

1.4 通過基因突變提高廣譜性抗體的廣譜性和親和力

通過前文所述的3種方法獲得廣譜性抗體后,可以借助基因突變等基因工程技術進一步提高廣譜性抗體的廣譜性和親和力,基因突變主要分為隨機突變和定點突變2種(圖5)。

簡便、快速的隨機突變方法結合有效的篩選策略(如借助噬菌體展示技術或核糖體展示技術進行篩選)有助于獲得親和力更高的抗體。LEIVO等[22]通過隨機突變使得一種識別喹諾酮類藥物的抗體的親和力顯著提高,使其對沙氟沙星的IC50降低20倍以上,對馬波沙星的IC50降低近3倍。

通過預測抗原抗體識別的關鍵氨基酸位點,并利用定點突變的方法將目標氨基酸的1 個位置或多個位置被其他19種氨基酸隨機替換,從而使抗體的廣譜性及親和力發生變化,選擇突變后廣譜性和親和力均提高的抗體,這種改性的方法同樣也適用于廣譜性抗體。WEN等[23]為了制備能夠識別喹諾酮類藥物的通用抗體,以諾氟沙星單克隆抗體為基礎制備了可識別17種常見的喹諾酮類藥物的廣譜性單鏈抗體,為了進一步提高其廣譜性和親和力,采用同源建模構建抗體的結構,分析了關鍵氨基酸殘基并對抗體中的抗原互補決定區3(complementarity determining region 3,CDR3)的關鍵氨基酸進行定點突變,最終篩選得到了既保留了對以上17種喹諾酮類藥物的廣譜性,又可特異性識別沙拉沙星、二氟沙星和曲伐沙星的高親和抗體。ZHONG等[24]利用定點突變的方法增強單鏈抗體的廣譜性,最終獲得一種可以識別5種Cry1Ab毒素的廣譜性抗體突變體D9。JIAO等[25]采用同源建模和分子對接技術分析了Cry1Ab毒素單域抗體A8與5種Cry1毒素的關鍵氨基酸結合位點,然后對關鍵氨基酸進行位點飽和突變。最后篩選出針對多種Cry1毒素的高親和力廣譜性抗體,比親本親和力高20倍。

A-Cry1類毒素結構分析;B-探尋Cry1類毒素共有結構及氨基酸,合成多肽抗原并進行免疫;C-基于廣譜性抗體的7種Cry1類毒素檢測標準曲線分析圖4 Cry1類毒素免疫原設計、合成及廣譜性抗體制備Fig.4 Immunogen design, synthesis, and broad-spectrum antibody preparation of toxoid Cry1

近年來定點突變與虛擬突變和虛擬篩選的聯合使用為提高廣譜性抗體的親和力提供了新的策略。WANG等[26]在已經制得的針對12種氟喹諾酮類藥物的廣譜性抗體的基礎上,結合虛擬突變的結果,將單鏈抗體的 Tyr99 定向突變為 His,結果表明,突變體對12種藥物的靈敏度提高了 7 倍,對 12 種藥物的檢測限為0.3～8.0 ng/mL。

同源建模及分子對接等生物信息學技術的發展雖然使得構建的結構模型的準確性得到了顯著提高,但其構建的三維模型與真實的結構仍然存在差異,并不能完全反映其真實結構,仍存在一定的發展空間。

圖5 提高廣譜性抗體的廣譜性和親和力的主要方法Fig.5 Main methods for improving the corss-reactivity and affinity of broad-spectrum antibodies

2 廣譜性抗體在食品安全快速檢測中的應用現狀

2.1 食品中毒素類危害物的檢測

食品中毒素類危害物種類繁多,真菌毒素和藻類毒素是食物中主要的2種生物毒素。真菌毒素的主要種類有黃曲霉毒素(aflatoxins,AFS)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌醇(deoxyni- valenol,DON)等,其普遍存在于玉米、大米、小麥、油、牛奶、水果及相關加工產品中,大部分真菌毒素具有致癌、致畸性、致突變、免疫毒性、肝毒性、神經毒性、皮膚毒性等多種毒性作用[27]。藻類毒素主要包括肝毒素、神經毒素和內毒素,藻類毒素能夠引起腹瀉、神經麻痹、肝損傷、中毒甚至死亡[28]。因此食品中的真菌毒素、藻類毒素的高通量檢測對保障食品安全具有重要意義。每一類毒素的結構相似性(如ZEN都有與雌激素相似的結構;AFS基本結構中都有二呋喃環和氧雜萘鄰酮[19]等)為廣譜性抗體的創制及應用提供了可行性。

WANG等[29]根據ZEN的分子結構和活性部位,設計了人工抗原,研究得出用肟化活性酯法制備免疫原ZEN-牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)免疫動物,獲得的針對ZEN及其類似物的廣譜性抗體最優,并且WANG等[30]利用該抗體建立了針對ZEN及其5個同系物的異源間接競爭性ELISA免疫檢測法。張海棠等[19]根據黃曲霉毒素B1(AFB1)的分子結構和活性位點,合成人工抗原AFB1-BSA,最終制備出了高效價、靈敏、廣譜的AFB1單克隆抗體。LU等[31]通過將微囊藻毒素(Microcystin,MC)中的MC-LR和鑰孔戚血藍蛋白偶聯,最終免疫獲得能夠同時檢測9種微囊藻毒素和結核素的廣譜性抗體,并通過異源包被策略來提高檢測的靈敏度,最終建立了一種廣譜、高靈敏的競爭性間接酶聯免疫吸附檢測法。

2.2 食品中農獸藥殘留的檢測

農藥用于控制、調節、預防或驅除影響植物生長的疾病、雜草、昆蟲和害蟲[32]。獸藥在養殖實踐中通常用于預防治療疾病、促進動物生長。農藥和獸藥的合理使用可以防止農業和畜牧業的破壞性損失,從而滿足全球人口增長的需求。然而,過度使用或濫用殺蟲劑和獸藥會導致這些物質在食品中殘留,并通過食物鏈進入人體,產生累積毒性、細菌耐藥性等一系列危害,對人體健康構成威脅,因此,農藥和獸藥殘留的高效檢測是一個重要的全球性食品安全問題[33]。大部分農獸藥均屬于家族類小分子化合物,因此,廣譜性抗體的應用為農獸藥殘留提供了新的高效檢測思路。

SHI等[34]制備了一種可以同時識別氯丙嗪、異丙嗪、乙酰丙嗪等5種吩噻嗪類藥物的廣譜單克隆抗體,并利用定點誘變技術將抗體輕鏈互補決定區2的Phe 164突變為Pro 164,制得了一種單鏈抗體基因突變體,突變體對5種藥物的親和力得到較大提升。LI等[35]利用合理設計的4-[(4-氨基苯基)磺酰基-氨基]-2-甲氧基苯甲酸半抗原與牛血清白蛋白進行生物偶聯,制備了抗磺胺類藥物的廣譜、高親和力的多克隆抗體(pAb)[35]。GALVIDIS等[36]將2種具有廣譜性的單克隆抗體結合使用,建立了一種雙競爭性夾心酶聯免疫吸附檢測法,該法適用于測定14種磺胺類藥物的最大殘留限量濃度。CHEN等[37]研究了喹諾酮類藥物與以吡哌酸為半抗原所產生抗體之間的交叉反應性,并與已報道的交叉反應性數據及半抗原組成進行比較,分析了抗原抗體的三維定量結構-活性關系,結果表明,形狀像字母“Y”的半抗原構象對于產生具有廣譜性和高交叉反應性的抗體具有關鍵作用,該研究結果對準確設計半抗原、預測抗體的特異性以及更好地理解抗原和抗體之間的識別機制具有重要意義。LIU等[38]利用分子模型和主成分分析選擇合適的半抗原,最終建立了一種針對10種三嗪類除草劑的廣譜性異源免疫測定法。王弘等[39]從噬菌體展示納米抗體文庫中篩選得到了一種針對二乙氧基有機磷農藥的納米抗體,該納米抗體能夠檢測多種二乙氧基有機磷,且檢測結果準確、穩定性好。YIN等[40]針對α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)類化合物的結構特點,制備出可同時識別6種α-ZAL類化合物的高靈敏廣譜單克隆抗體,建立了能同時檢測多種α-ZAL類化合物的酶聯免疫吸附法。WANG等[41]根據全息圖和三維定量結構-活性關系得出β-激動劑半抗原上有2個影響抗體特異性的關鍵結合表位,且C-2′表位上的叔丁基是產生廣譜性抗體的必要條件,本研究最終開發了一種可用于識別23種β-激動劑和類似物的競爭抑制酶聯免疫吸附檢測法。表1為更詳細的廣譜性抗體在農獸藥殘留檢測中的應用舉例。

表1 廣譜性抗體在農獸藥殘留檢測中的應用Table 1 Application of broad-spectrum antibodies in detection of pesticide and veterinary drug residues

2.3 其他

除了在毒素污染和農藥殘留檢測方面的應用,廣譜性抗體還被廣泛應用于其他多種危害物的高通量檢測,如作為口服藥使用的磺酰脲類藥物、混入食物中的植物毒素生物堿、肉類食品中的蛋白質經加工后產生的雜環胺、作為抗生素的青霉素、動物體內的雄激素等。

磺酰脲類藥物是一類廣泛應用于臨床治療的降2型糖尿病藥物,然而,近年來,為了改善聲稱的抗糖尿病活性,人們往往在多種草藥茶中非法摻假。當處于最低能量構象時,所有的磺酰脲類藥物都具有相似的J型構象和分子靜電勢等值面。XIE等[51]合理設計了一種新型半抗原,并開發出一種可以識別9種磺脲類藥物的廣譜性單克隆抗體,為多種涼茶產品中非法摻假成分的現場檢測提供了一種高效快速的方法。生物堿大多數有復雜的環狀結構,氮素多包含在環內,有顯著的生物活性。WANG等[52]通過研究10種主要生物堿及其代謝物的結構選取合適的半抗原,最終得到了一種廣譜的抗生物堿單克隆抗體,并以此為基礎開發了一種間接競爭性酶聯免疫吸附檢測法,可以用于快速篩查豬尿、豬肉和谷類面粉樣品中的阿托品、東莨菪堿、高阿托品、茴香堿、茴香堿和L-羥胺的殘留。雜環胺(heterocyclic aromatic amines,HAAs)是在高溫烹調加工各種蛋白質含量豐富的食品時產生的一類具有致突變、致癌作用的物質,研究表明,長期食用含雜環胺的熟肉制品,可增加癌癥的發生率,特別是結、直腸部位。SHENG等[53]通過合成半抗原最終得到一種可以同時測定8種HAAs的廣譜性抗體,用于檢測加熱處理肉類中的雜環胺殘留。青霉素是最常用的一類廣譜抗生素,含有共同的母核結構,不同的青霉素之間由不同側鏈結構予以區分,獸醫臨床上常把它作為消炎抗感染的首選藥使用,但治療人員為了追求治療效果,出現了濫用或超劑量使用的現象,造成藥物在動物體內的殘留[54]。劉偉怡等[55]通過活潑酯法將青霉素G(penicillin,PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-卵清蛋白,將PEN-BSA免疫新西蘭大白兔獲得可以同時測定8種青霉素類抗生素的多克隆抗體,并建立了異源ELISA檢測法用于測定牛奶中青霉素類抗生素的殘留。動物可食用組織中雄激素的殘留具有多種危害,如造成頭痛、胸悶、心悸、肌肉疼痛、禿發、內分泌紊亂、染色體畸變和生殖毒性。雄激素是常見的甾體結構化合物之一,主要區別在C-17或C-19位的甲基末端取代基上,不同的雄激素在空間構象上具有一定的相似性,這為通用抗體的制備提供了可能。GAO等[56]使用MT-CMO-KL作為半抗原制備廣譜性抗體,最終開發了一種準確度高的用于檢測動物可食用組織中多種雄激素殘留物的間接競爭酶聯免疫分析方法。

由上可知,某一類危害物的結構相似性為廣譜性抗體的制備及應用提供了理論依據,針對更多危害物的廣譜免疫學檢測法也將因其“高效、經濟、簡便”的特點得到更廣泛的應用,為不同領域帶來經濟安全雙效益保障。

3 廣譜性抗體在食品安全快速檢測領域的發展趨勢

廣譜性抗體在食品安全領域的開發與應用目前主要有2個問題:(1)半抗原設計盲目性仍較高,“試錯”法仍然是大部分研究所用的方法;(2)廣譜性抗體的檢測靈敏度普遍較低,一些創新性的研究針對這2個問題做出了解答,同時也對廣譜性抗體的未來研究方向有一定的指導作用。

盡管制備廣譜性抗體有多種方法,但是通用型結構抗原法是使用最廣泛的方法,半抗原的設計是該法中的關鍵性步驟,目前大多數研究中仍然使用二維的共性結構分析加實驗“試錯”的方法篩選所需的半抗原,由于抗原的立體化學和電子性質在與抗體的相互作用中起著重要作用,因此半抗原的設計不應僅考慮二維結構,還應考慮三維構象以及是否容易獲得等多個因素[35]。雖然傳統方式也可以進一步結合多方面的信息進行精細篩選,但是能夠模擬特定抗體的交叉反應細節且成本低的建模方式,是改進傳統“試錯式”半抗原設計更好的選擇。同時,了解抗原抗體的識別機制對于提高廣譜性抗體的性能以及指導免疫分析方法的建立具有重要作用。

目前廣譜性抗體的檢測靈敏度并不理想,這與所用的篩選策略和建立的檢測方法均有關,如研究表明非競爭性免疫檢測法、異源性檢測方法均可以在一定程度上提高檢測靈敏度。