乳糖醇調節液態發酵紅曲菌生長及莫納可林K代謝的研究

許世錦，胡文林,陳羅華周,聶增宇,陳玲娟

(廣東天益生物科技有限公司,廣東 湛江,524300)

1979 年日本學者遠滕章(AKIRA ENDO)教授發現紅曲霉(Monascusruber)能產生強力抑制膽固醇合成的活性物質,將其命名為莫納可林K(Monacolin K,MK)[1]。1985 年又相繼分離到Monacolin L、X、J、Dihydroerinolin和Dihydromonalin L 等類似物,它們都具有相同的基本結構(L 是J 的前驅物,J 是K 的前驅物),同時又都具有很強的降低膽固醇的作用[2]。其中,紅曲中的MK 作用最強,能高效地抑制膽固醇合成中的關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶的活性,進而調節血脂水平[3]。

目前,國內MK 的生產全部以大米為碳源、采用塑料三角瓶固態發酵方式生產。與傳統固態發酵法相比,液態發酵法具有規模大、自動化程度高、人力成本低及生產過程中可以控制雜菌污染的顯著優點。據報道以乳糖為碳源的液態發酵產127 mg/L 的MK,為國外紅曲菌液態發酵MK 的最高產量[4]。甘油作為常用碳源之一,對紅曲菌生長和代謝有著重要作用,且能大幅提高合成MK 基因的轉錄水平[5]。目前國內采用甘油與葡萄糖或米粉作混合碳源的液態發酵產MK 的研究,進展顯著[6-8],尤其當甘油與淀粉[m(甘油)∶m(淀粉)=3∶1]為混合碳源的液態發酵產MK可達1 302 mg/L[9],但以采用純甘油為碳源的搖瓶與15 L小型發酵罐液態發酵產MK的產量最高,分別為1 600、888.9 mg/L[10]。另外,在甘油與淀粉為混合碳源的培養基中,再添加非離子表面活性劑對MK產量的提高效果更為明顯[11],尤其是添加非離子表面活性劑Triton X-100,液態發酵產MK可達到 2 026.0 mg/L[12],效果極顯著。上述液態發酵技術中,甘油作為碳源發酵生產應用于食品、保健品、藥品作為原料的MK 制品,不符合GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》和QB/T 2847—2007《國家輕工行業標準 功能性紅曲米(粉)》,無法量產。非離子表面活性劑Triton X-100雖可大幅提高MK的產能,但具有毒性,且紅曲菌無法利用,其在產品中的殘留物的清除方法及其對產品質量的影響等方面尚需深入的理論研究。由于采用大米淀粉作為碳源利于產色素,而不利于產MK[13],產MK值不足100 mg/L,無經濟價值。目前尚未見采用符合GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》和QB/T 2847—2007《國家輕工行業標準 功能性紅曲米(粉)》的原料作為碳源進行液態發酵生產MK的相關報道。

基于此,本文擬研究糖醇對紅曲菌TY02生長與代謝的影響,探討糖醇對紅曲菌TY02的MK代謝調控機理,以期為谷物淀粉等物質作為碳源、且符合GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》和QB/T 2847—2007《國家輕工行業標準 功能性紅曲米(粉)》的原料進行的液態發酵大幅提高紅曲菌MK的代謝能力、突破液態發酵低產MK的技術瓶頸、實現功能紅曲液態發酵量產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

紫色紅曲菌TY02(MonascuspurpureusTY02)為廣東天益生物科技有限公司保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號為CCTCC M2018586的保藏菌株。

1.1.2 實驗儀器

HWY-2112型雙層恒溫培養搖床,上海智城分析儀器制造有限公司;LC-20AD高效液相色譜儀、SPD-20A紫外分光檢測器，日本島津儀器有限公司;SW-CJ-1FD型超凈化工作臺,蘇州凈化器設備有限公司;LS- B50L型立式蒸汽滅菌鍋,上海醫用核子儀器廠;LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機,上海安亭科學儀器廠;DHG-9140A型鼓風干燥箱、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋、LRH-150型生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;B2200S型超聲波清洗器,必能信超聲(上海)有限公司;MP502B型電子天平,上海精密實驗器材有限公司

1.2 培養基

斜面培養基:12 °Bx麥芽汁培養基

種子培養基(g/L):葡萄糖60,蛋白胨25,玉米漿10,NaNO32,MgSO4·7H2O 1,K2HPO4·3H2O 1.5,pH值自然。

發酵培養基(g/L):黏米粉120,大豆水解液40,玉米漿5,NaNO33.5,MgSO4·7H2O 1.5,K2HPO4·3H2O 2.5,pH 4.5。

1.3 培養條件及方法

斜面培養:挑取1環菌種接種于斜面培養基中,在30 ℃培養箱中培養至菌絲長滿斜面。

種子液培養:用10 mL無菌水洗滌試管斜面孢子,接種至含有100 mL種子液培養基的500 mL三角瓶中,在30 ℃ 200 r/min的旋轉搖床上培養48 h。

液體搖瓶發酵培養:將種子液按12%(體積分數)接種量接種于裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中,在30 ℃ 180 r/min的旋轉搖床上培養 3 d,然后于24～25 ℃發酵至22 d。

1.4 分析方法

菌體量的測定:菌體量采用干重法測定。取發酵液,用3 層紗布過濾,蒸餾水洗滌2～3 次,擰干,在60 ℃ 烘箱中烘干至恒重。菌體量[生物量(dry cell weight,DCW)]的計算如公式(1)[14]所示:

(1)

MK的測定按QB/T 2847—2007《國家輕工行業標準 功能性紅曲米(粉)》執行:發酵液的預處理。稱取發酵液或發酵液濾液5 g,加入35 mL 75%(體積分數)分析純乙醇,超聲波萃取50 min,然后再加入適量的75%分析純乙醇,再超聲波萃取10 min,冷卻,定容至50 mL,離心分離10 min(3 500 r/min),然后用0.45 μm的有機微孔濾膜過濾,濾液用于測定MK,測定的MK為總MK。胞外MK的測定是以發酵醪液經濾紙過濾后的濾液為樣品,樣品預處理方法和測定方法與總MK的測定相同。

色譜條件:色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm),柱溫20～25 ℃,紫外檢測器:238 nm檢測波長,流動相:V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=385∶115∶0.14,流速為1.0 mL/min,進料量為20 μL。

桔青霉素的測定:按GB 5009.222—2016《食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定》中的第一法執行。

乳糖醇的測定:按GB 1886.98—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 乳糖醇 (又名4-β-D吡喃半乳糖-D-山梨醇)》執行。

1.5 數據統計分析

使用IBM SPSS?Statistics 20(NY,USA)對不同糖醇添加條件下菌絲體生物量和MK產率進行單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用最小顯著差法(least significant difference,LSD)方法。每組的樣本量為20,顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 糖醇種類及部分對應糖對紫色紅曲菌TY02生長和MK代謝的影響

以1.2培養基中的發酵培養基為基本發酵培養基,在發酵初始時(0 d)分別添加30 g/L麥芽糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、乳糖醇、異麥芽糖醇、木糖、麥芽糖、乳糖,按照1.3的方法進行培養,菌體DCW、MK質量濃度與糖醇種類及部分相應糖的關系如圖1所示。

a-糖醇;b-糖以及對應的糖醇圖1 糖醇和糖種類對紫色紅曲菌TY02菌絲體DCW和MK產量的影響Fig.1 Effects of sugars and sugar alcohols on the mycelial biomass DCW and MK yield of Monascus purpureus TY02注:a～f,*a～*g不同標記字母分別表示菌絲體DCW和MK產率在不同糖醇種類添加下組間差異顯著(P<0.05)

由圖1-a可知,在不同種類糖醇添加的條件下,紫色紅曲菌TY02的生長與MK代謝均呈正增長,菌體DCW與產MK呈正相關的關系。其中,添加木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇效果較佳,尤以添加乳糖醇效果最佳,菌體DCW與MK質量濃度分別為45.96、48.83、52.65 g/L和291、482、665 mg/L,分別為對照組(DCW 33.08 g/L、MK 75 mg/L)的1.39、1.48、1.59倍和3.88、6.43、8.87倍(P<0.05)。實驗表明紫色紅曲菌TY02能夠利用糖醇作為碳源,糖醇對菌體生長具有促進作用[15],同時能顯著提高MK 的代謝能力。

由圖1-b可知,不同種類的糖和對應的糖醇均能顯著促進紫色紅曲菌TY02的菌體生長,但添加糖類的菌體DCW均高于對應的糖醇,這說明紫色紅曲菌TY02優先利用糖類作為碳源。與對照組相比,糖類雖能顯著促進紫色紅曲菌TY02的生長,但其產MK能力明顯不足,這表明代謝過程中產生的葡萄糖可顯著地抑制紅曲菌TY02的MK代謝[16]。實驗表明,相對于添加糖類,糖醇更能促進紫色紅曲菌TY02合成MK,因此可推測,糖醇既可作碳源,還影響紫色紅曲菌TY02的MK代謝途徑。

2.2 乳糖醇添加量及添加時間對紫色紅曲菌TY02生長和MK代謝的影響

以1.2培養基中的發酵培養基為基本發酵培養基,分別在發酵初始時(0 d)添加20、40、60、80、100、120 g/L乳糖醇,以及在發酵0、2、4、6、8、10、12 d分別添加80 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進行培養,菌體DCW、MK質量濃度與乳糖醇質量濃度和添加時間的關系如圖2所示。

a-DCW和MK質量濃度;b-DCW和MK質量濃度圖2 乳糖醇添加量及添加時間對紫色紅曲菌TY02DCW和MK產量的影響Fig.2 Effects of lactitol concentration and addition time on the mycelial biomass DCW and MK yield of Monascus purpureus TY02

由圖2-a可知,紫色紅曲菌TY02的菌體DCW與乳糖醇的濃度呈正相關的關系,產MK的質量濃度隨著乳糖醇濃度的增加而增加,至乳糖醇質量濃度為80 g/L時,MK達極值。此時DCW為60.92 g/L,MK為1 018 mg/L,分別為對照組(乳糖醇添加量為0 g/L)(DCW 33.47 g/L、MK 78 mg/L)的1.82倍和13.05倍,此后隨著乳糖醇濃度的進一步提高,MK呈遞減趨勢。

實驗表明,添加過多的糖醇,紫色紅曲菌TY02會趨向菌體生長,而不利于合成MK,這可能是碳氮比過高會導致紫色紅曲菌TY02將更多的能量用于菌體生長[17]。上述結果表明,紅曲菌發酵過程中添加適量的乳糖醇極利于MK的合成,乳糖醇添加的最佳質量濃度為80 g/L,這與文獻報道的以甘油為碳源的發酵產MK類似[18]。

由圖2-b可知,在不同的發酵時間添加乳糖醇對紫色紅曲菌TY02的菌體生長與MK代謝的影響程度各不相同。與對照組相比,菌體DCW均呈正增長,MK產量均得到提高,兩者均為正效應,兩者均在0 d添加最大,此時DCW為61.21 g/L、MK為1 023 mg/L,分別為對照組DCW 33.81 g/L、MK 76 mg/L的1.81倍和13.46倍。乳糖醇最佳的添加時間節點為發酵初始時間(0 d),這與文獻報道的紅曲黃色素發酵類似[19]。

2.3 乳糖醇對總MK、胞外MK、開環MK代謝的影響

以1.2培養基中的發酵培養基為基本發酵培養基,在發酵初始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇,以及在發酵初始時(0 d)分別添加0、20、40、60、80、100、120 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進行培養,總MK質量濃度、胞外MK質量濃度、胞外MK占比與發酵時間的關系和開環MK占比與乳糖醇添加量的關系如圖3所示。

a-總MK、胞外MK、胞外MK占比;b-開環MK占比圖3 紫色紅曲菌TY02發酵過程中總MK產量、胞外MK產量以及胞外MK比例的變化及乳糖醇添加量對開環MK比例的影響Fig.3 Changes of yields of total MK and extracellular MK,as well as the ratio of extracellular MK during fermentation,and effects of lactitol additives on the ratio of open-loop MK in the broth of Monascus purpureus TY02

由圖3-a可知,紫色紅曲菌TY02在發酵初始時(0 d)添加0 g/L乳糖醇,其代謝的總MK、胞外MK、胞外MK占比的走勢基本上一致,表現為隨著發酵時間的增加而遞增,發酵至22 d,上述三者均達最大值,此時總MK、胞外MK、胞外MK占比分別為87、37 mg/L和42.53%。在發酵初始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇,產總MK的走勢與前者相似,但胞外MK、胞外MK占比與對照組明顯不同。其中胞外MK方面:在8～16 d即發酵前、中期時的MK產率增長顯著,至16 d開始放緩,產率達極大值,發酵后期MK產率漸趨平穩并逐步下降,至發酵20 d,胞外MK達極值780 mg/L。胞外MK占比方面:在發酵的前、中期時其走勢為隨發酵時間的增加而遞增,至16 d達極大值,此時胞外MK占比為86.71%,為對照組同期(35%)的2.48倍,此后隨發酵時間的增加而呈下降趨勢。實驗組發酵至22 d,總MK達極值,其總MK、胞外MK、胞外MK占比分別為1 031、754 mg/L和73.13%,分別為對照組的11.85倍、20.38倍和1.72倍。可見發酵初始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇能大幅提高紫色紅曲菌TY02的MK產量與胞外MK占比,這與文獻報道的紅曲霉產黃色素的發酵相類似[19]。胞外MK占比的大幅提高,乳糖醇可能類似于甘油通過影響脂肪酸的組成從而增加細胞膜的通透性,進而有利于代謝產物外排[20-21]。

MK分為內酯型和酸型兩種結構,在一定的條件下兩者可以轉換[22]。由圖3-b可知,發酵液中開環MK占比隨著乳糖醇濃度的增加,呈現快速遞增趨勢,至乳糖醇添加量為80 g/L時開始放緩,此時開環MK占比為98.56%,為對照實驗開環MK占比25.33%的3.89倍,此后隨著乳糖醇濃度的進一步提高,開環MK占比漸趨平穩,維持在98%～99%。這說明,乳糖醇能大幅提高紫色紅曲菌TY02的開環MK的合成比例,從而使生產水溶性的高開環功能紅曲MK成為可能[23]。

2.4 乳糖醇添加量對乳糖醇殘留及桔青霉素代謝的影響

以1.2培養基中的發酵培養基為基本發酵培養基,在發酵初始時(0 d)分別添加0、20、40、60、80、100、120 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進行培養,乳糖醇殘留量、桔青霉素的質量濃度與乳糖醇添加量的關系如圖4所示。

由圖4-a可知,發酵結束后發酵液中乳糖醇的殘留量隨著培養基中添加的乳糖醇濃度的增加而增加,殘留量變化范圍為0.17～5.83 g/L,符合GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》。紫色紅曲菌TY02對乳糖醇的利用率會隨著培養基中乳糖醇濃度的增加而逐漸降低,利用率變化趨勢為99.13%～95.14%。當添加乳糖醇質量濃度至80 g/L時,乳糖醇利用率明顯下降,此時乳糖醇殘留量為1.84 g/L,利用率為97.70%。實驗表明,紫色紅曲菌TY02能夠適應高滲透壓的培養基環境,在生長與MK代謝過程中能較充分地利用乳糖醇。此外因過高的乳糖醇濃度利于長菌而不利于產MK,同時會增加在發酵液中的殘留量,給后處理及產品質量帶來隱患,故選擇乳糖醇的添加量為80 g/L較為合適,這與前面的實驗結論一致。

a-乳糖醇殘留量;b-桔青霉素質量濃度圖4 乳糖醇添加量對乳糖醇殘留量及桔青霉素含量的影響Fig.4 Effects of amount of lactitol additive on content of residual lactitol and citrinin after fermentation

由圖4-b可知,發酵液中桔青霉素隨著乳糖醇濃度的增加,其質量濃度由對照組的112 μg/kg呈快速遞減趨勢,兩者呈負相關。當乳糖醇添加量增至80 g/L時,其含量僅為6 μg/kg,此后隨著乳糖醇濃度的進一步提高,桔青霉素含量無法檢出。實驗表明,乳糖醇能抑制紫色紅曲菌TY02合成桔青霉素的酶系。

2.5 添加乳糖醇條件下紫色紅曲菌TY02發酵MK的收獲時間

以1.2培養基中的發酵培養基為基本發酵培養基,在發酵開始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進行培養,MK質量濃度、pH值、菌體DCW與發酵時間的關系如圖5所示。

由圖5-a可知,在發酵前期,pH不斷上升,至12 d時至最高,此時pH值為6.95,此后略有下降,并漸趨平穩,維持在6.7左右至發酵結束。當pH<6.0時為菌體的生長期,pH>6.0時為MK的合成期,8～16 d為菌體合成MK的高峰期,16 d時MK合成開始放緩,此后MK合成漸趨平穩,至22 d時MK達極值1 031 mg/L。

a-pH值與MK質量濃度;b-生物量DCW和MK質量濃度圖5 發酵過程中MK質量濃度、pH值、菌體生物量DCW的變化Fig.5 Changes of MK yields,pH values and mycelial biomass DCW during the fermentation

由圖5-b可知,在發酵前期,菌體快速增殖,至6 d時,DCW由初始的11.86 g/L快速增長至75.62 g/L,此后緩慢降低,至發酵結束降至59.87 g/L。當DCW從72.41 g/L降至65.33 g/L(8～16 d)期間為MK合成的高峰期,在DCW降至65.33 g/L時(16 d)MK合成開始放緩,此后MK合成漸趨平穩,至22 d時MK達最大值1 031 mg/L。從DCW與MK合成的關系圖可知功能紅曲液態發酵為典型的次級代謝,并且為高密度發酵。

3 結論

研究結果表明,乳糖醇對紫色紅曲菌TY02的生長及MK代謝具有重大的影響。

研究發現該菌株在以黏米粉為碳源,在發酵初始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇的高滲透壓培養基中能夠進行高密度發酵,菌體DCW可達75.62 g/L,能夠高效合成高開環、高含量的MK,其中發酵液開環MK占比可達98%,總MK可達1 031 mg/L,從而突破了以不含甘油成分的淀粉質作為碳源、且符合QB/T 2847— 2007《國家輕工行業標準 功能性紅曲米(粉)》與GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》的原料進行液態發酵低產MK的技術瓶頸,使生產水溶性的功能紅曲制品成為可能。研究還發現,該菌株能高效利用乳糖醇作為碳源,在發酵初始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇,發酵22 d,經檢測發酵液中乳糖醇的殘留量為1.84 g/L,符合GB 2760 —2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》,從而解決了乳糖醇殘留量過高會引起腹瀉的隱患;同時發現,乳糖醇不僅可作為碳源,還可調節紫色紅曲菌TY02的MK代謝途徑。乳糖醇能夠抑制紫色紅曲菌TY02合成桔青霉素的酶系,在發酵初始時(0 d)添加80 g/L乳糖醇,發酵22 d,經檢測發酵液中桔青霉素的質量濃度由對照組的112 μg/kg降至6 μg/kg,符合QB/T 2847—2007《國家輕工行業標準 功能性紅曲米(粉)》,從而保證了以后量產的產品質量安全。本研究成果對突破當前液態發酵功能紅曲的技術瓶頸,進而實現量產,提供了理論參考和技術支持。受條件的限制,本研究未能采用實時熒光定量qPCR測定MK合成關鍵基因的表達量,對乳糖醇影響紫色紅曲菌TY02產MK的機理未能進行充分的解析。因此,研究糖醇促進紅曲菌產MK的機理將是今后工作的重點。