五峰土家族自治縣泡菜水品質評價及其乳酸菌多樣性解析

張苗苗,解云,王玉榮,葛東穎,王婷,楊瑩,郭壯*

1(湖北文理學院,湖北省食品配料工程技術研究中心,湖北 襄陽,441053)2(湖北文理學院,乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室,湖北 襄陽,441053)3(襄陽市公共檢驗檢測中心,湖北 襄陽,441001)

作為傳統的發酵蔬菜制品,泡菜常以卷心菜、白菜、辣椒和蘿卜等為主要原料,添加少量食鹽和花椒等佐料腌漬而成,因具有酸脆爽口的獨特風味而深受消費者的喜愛[1]。我國多數地區都有制作和食用泡菜的習俗,但因地域、原材料和制作方式存在差異,導致各地的泡菜種類不盡相同[2],總體可分為泡漬泡菜和鹽漬泡菜兩大類[3]。泡菜中乳酸菌的多樣性和豐度均較高,CAO等[4]采用純培養方法從重慶地區采集的126份傳統四川泡菜老鹽水樣品中分離鑒定出240株乳酸菌,分屬于4個菌屬的16個菌種。XIAO等[5]通過基因測序、預測功能和相關性分析發現,乳酸桿菌(Lactobacillus)在江西腌菜、四川泡菜和東北酸菜中均占有高達77.6%的比例,并發現3種傳統泡菜中乳酸菌與超過20種風味化合物緊密相關,碳水化合物、氨基酸和核苷酸代謝為其主要的代謝特征。由此可見,積極開展泡菜制品微生物類群和產品品質的關聯性分析,對提升泡菜的風味品質具有重要作用。

電子舌[6]和電子鼻[7]仿生學技術具有靈敏度高和穩定性好等特點,可全方位并多角度地實現食品滋味和風味品質的數字化評價,被廣泛用于調味品[8]、乳制品[9]和肉制品[10]等相關研究領域。郭壯等[11]使用電子舌和電子鼻技術對安康地區泡菜水品質進行評價,并對泡菜水品質和細菌多樣性的關聯性進行了研究,發現泡菜水的菌群結構和品質結構呈現顯著相關,其中Lactobacillus對泡菜品質的形成具有重要作用。五峰土家族自治縣地處鄂西南邊界,境內溝壑縱橫、峰巒重疊、垂直氣候帶譜明顯,是一個以土家族和漢族為主的多民族自治縣,當地居民亦具有制作和食用泡漬泡菜的風俗習慣。然而,目前有關五峰土家族自治縣泡菜品質特征與乳酸菌種類之間是否存在聯系的研究尚少。

本研究立足區域特色,使用電子舌和電子鼻聯用技術對采自湖北省宜昌市五峰土家族自治縣的17個泡菜水滋味和風味品質進行評價,并采用純培養技術對其蘊含的乳酸菌進行分離和鑒定,以期使關于我國泡菜品質和微生物類群研究的數據更為豐富,同時為后續泡菜的相關研究提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

泡菜水購于五峰新縣城菜市場、大房坪農貿市場、古潭農貿綜合市場和五峰鎮菜市場,共購買17個樣品,樣品均為使用五峰土家族自治縣(E111°15′～111°25′,N29°56′～30°25′)自產的辣椒為主要原料制作。

1.1.2 試劑

電子舌測試配套溶液,日本Insent公司;MRS和LB培養基,青島海博生物技術有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)、乙酸鈉、乙醇、酚、氯仿和異戊醇,國藥集團化學試劑有限公司;PCR buffer、dNTP mix、rTaq酶、Solution I、pMD18-T載體和Loading buffer,寶生物工程(大連)有限公司;DL 2000 Marker,寶日醫生物技術(北京)有限公司;引物27F/1495R和M13F(-47)/M13R(-48),武漢天一輝遠生物科技有限公司;Axygen PCR清潔試劑盒,康寧生命科學吳江有限公司;Escherichiacolitop10,湖北省食品配料工程技術研究中心制備。

1.2 儀器與設備

5810R臺式高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;SA402B型電子舌(5個傳感器),日本Insent公司;PEN3型電子鼻(10個傳感器),德國Airsense公司;DG250型厭氧工作站,英國Don Whitley公司;Veriti FAST梯度PCR儀,美國ABI公司;164-5050基礎電泳儀,美國Bio-Rad公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統,美國Protein Simple公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡菜水樣品的滋味評價

采集的泡菜水以300 r/min離心10 min去除殘留雜質,取40 mL上清液與80 mL的超純水混合均勻后以8 000 r/min離心5 min,最后取上清液待測。研究使用王玉榮等[12]的方法并稍作修改,對上清液中5個基本味和3個基本味的回味進行測定,每個樣品測試4次,選用后3次的平均值作為原始數據,進行后續分析。因SA402B電子舌每次可對10個樣品滋味品質進行測定,故而納入本研究的17個樣品共需2批次完成測試,為減少系統誤差對數據結果的影響,在每輪次測試過程中1號位均放置實驗室自己制作的泡菜水作為對照組,即第1輪次測試對照組和A1～A9號樣品,第2輪次測試對照組和A10～A17樣品。每輪次測試完成后所得各樣品的各滋味指標強度減去本輪次對照組樣品各滋味指標的強度即可得該樣品各指標的相對強度值,因2批次所得數據矩陣中對照組樣品各指標數據均為0,故而可以將2批次測試數據進行合并,并在此數據矩陣基礎上開展后續多元統計學分析。

1.3.2 泡菜水樣品的氣味評價

取15 mL泡菜水于50 mL樣品瓶中,先放于50 ℃ 水浴鍋加熱30 min,再放于室溫平衡15 min后待測。研究使用楊淑花等[13]的方法并稍作修改,最終在60 s的測試時間中選用第49、50、51 s時各傳感器響應值的平均值作為原始數據,進行后續分析。

1.3.3 泡菜水中乳酸菌的分離與純化

使用倍比稀釋法將各泡菜水樣品從10-1稀釋至10-6梯度,選取10-4、10-5和10-6梯度的稀釋液涂布于添加1.0%(質量分數)碳酸鈣的MRS固體平板中,在30 ℃厭氧條件(85%N2,10%H2和5%CO2)下倒置培養48 h,挑取形態、大小和顏色等各不相同且具有透明圈的單菌落[14]連續劃線3次后轉接于 5 mL MRS液體試管中30 ℃培養24 h,最后收集過氧化氫酶實驗陰性且革蘭氏染色陽性菌株的菌體,添加1 mL 30%(體積分數)的甘油,凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.4 泡菜水中乳酸菌的鑒定及登錄號的申請

CTAB法提取乳酸菌分離株的DNA[15],進而以DNA為模板并參考蔡宏宇等[16]的擴增體系與程序進行PCR擴增。待擴增結束后,取2.5 μL的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,選用條帶清晰且無明顯拖尾現象的擴增產物進行清潔,再將清潔產物連接至pMD18-T載體,轉化到Escherichiacolitop10中,挑取鑒定結果為陽性的克隆子寄往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序,拼接返回的測序結果于美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnolo- gy Information,NCBI)進行比對分析,從而確定乳酸菌分離株的種屬關系。最后將分離菌株的序列上傳至GeneBank數據庫,獲得MT211319-MT211376的登錄號。

1.3.5 統計分析

使用非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)和主成分分析法(principal component analysis,PCA)進行泡菜水滋味與風味品質分析,使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗進行不同聚類間的差異性分析。

使用R軟件(v3.6.2)的vioplot、ggpubr和ggplot2軟件包繪制小提琴圖,pheatmap軟件包繪制乳酸菌分離株的熱圖,使用Origin 2017軟件繪制其他圖。

2 結果與分析

2.1 泡菜水的滋味品質評價

使用電子舌對采自五峰土家族自治縣的17個泡菜水的滋味品質進行分析評價,繪制各滋味指標相對強度值的小提琴圖,如圖1所示。

圖1 泡菜水各滋味指標的相對強度值Fig.1 Relative intensity values of each taste index of Paocai brine samples

由圖1可知,泡菜水在酸味指標上的差異最大,極差值為25.71;在咸味、澀味和鮮味上次之,極差值分別為17.1、16.21和10.4,但在苦味、后味B(苦味的回味)、后味A(澀味的回味)和豐度(鮮味的回味)指標上的差異相對較少,極差值分別為7.27、5.61、2.03和1.11。KOBAYASHI等[17]的研究表明,若樣品中某一滋味指標的相對強度值之差大于1,則其差異通過感官可以評鑒出。由此可見,泡菜水在酸味指標上的差異最大,造成此現象的原因可能是不同樣品中乳酸菌的構成與含量存在差異。CAO等[4]比較了3個酸度梯度泡菜水細菌類群的差異,結果發現不同分組泡菜水細菌類群存在顯著差異(P<0.05),但乳酸菌仍是不同分組樣品中的絕對優勢菌群。

2.2 泡菜水的風味品質評價

侯愛香等[18]采用氣相色譜-質譜聯用和固相微萃取的方法對湖南發酵芥菜樣品的揮發性風味組分進行研究,結果發現在泡菜的產香物質中酯類、醇類和萜類的含量較高,因此本研究選取了PEN3電子鼻中對芳香類、萜類和乙醇敏感的W1C、W3C、W5C、W1W和W2S傳感器對泡菜水進行了檢測,各傳感器的響應值強度如表1所示。

由表1可知,W1W和W2S傳感器對泡菜水的響應值較其余3個傳感器明顯偏高,說明樣品中乙醇和萜類物質的含量相對較高。5個傳感器響應值的變異系數均>28%,表明納入本研究的泡菜水在芳香類、萜類和乙醇指標間的差異均較大,其中乙醇和萜類物質的差異最為顯著。大量研究表明,泡菜中的香氣物質主要來源于蔬菜等原料本身,同時還包括乳酸菌和酵母菌等其他微生物發酵產生的風味物質[19],因而乙醇含量相對較高可能是制作泡菜時為防止微生物污染添加的白酒、發酵中乳酸菌與蔬菜中葡萄糖產生的異型乳酸發酵[20]和酵母菌的酒精發酵所引起。

表1 電子鼻各傳感器對泡菜水的響應值Table 1 Response values of each electronic nose sensor to Paocai brine samples

2.3 泡菜水滋味與風味指標相對強度的多元統計學分析

在對滋味與氣味評價的基礎上,本研究使用非加權組平均法對各樣品滋味與風味指標的相對強度進行多元統計學分析,聚類分析結果如圖2所示。

圖2 泡菜水滋味與風味指標相對強度的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of the relative intensity of taste and aroma indexes of Paocai brine samples

由圖2可知,除樣品A7和A11存在明顯的聚類差異外,其余15個泡菜水樣品亦呈現較明顯的聚類關系,其中樣品A2、A4、A10、A12、A14、A16和A17隸屬于聚類Ⅰ,樣品A1、A3、A5、A6、A8、A9、A13和A15隸屬于聚類Ⅱ。

選取聚類Ⅰ和聚類Ⅱ的樣品,采用主成分分析在空間上進行排布,結果發現,體現泡菜水整體滋味與風味品質的信息主要集中在前3個主成分(principal component,PC),累計貢獻率為86.16%。第一主成分(PC1)由W1C、W3C、酸味、澀味和鮮味等4個指標構成,貢獻率為53.43%;第二主成分(PC2)由W5C、W1W、W2S、苦味、咸味和后味B(苦的回味)6個指標構成,貢獻率為23.69%;第三主成分(PC3)由后味A(澀的回味)和豐度(鮮的回味)2個指標構成,貢獻率為9.04%。本研究選取第一主成分和第二主成分進行因子載荷圖和因子得分圖的繪制,用來比較2個聚類樣品在滋味與氣味上的品質差異,其結果如圖3所示。

a-因子載荷圖;b-因子得分圖圖3 泡菜水滋味與風味指標相對強度的主成分分析Fig.3 PCA of the relative intensity of taste and aroma indexes of Paocai brine samples

由圖3可知,隸屬于聚類Ⅰ的樣品均位于X軸的正半軸,具有較好的酸味品質,但風味的揮發性較弱,而隸屬于聚類Ⅱ的樣品均位于X軸的負半軸,具有較好的風味品質。通過Moon-Median檢驗,發現歸于PC1的4個指標在2個聚類樣品間的差異極顯著(P<0.001),而歸于PC2的6個指標在2個聚類樣品間無明顯差異(P>0.05)。因而,隸屬聚類Ⅰ的樣品酸味和澀味偏高,而隸屬于聚類Ⅱ的樣品風味品質比較好。

2.4 泡菜水中乳酸菌的種群結構

本研究在對泡菜水品質進行評價的基礎上,進一步采用傳統微生物學方法,對其蘊含的乳酸菌菌株進行了分離、鑒定和保藏。在17個樣品中共分離出57株乳酸菌,其中HBUAS56099等4株菌被鑒定為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的戊糖乳桿菌(L.pentosus),HBUAS56098等4株菌被鑒定為植物乳桿菌(L.plan-tarum),HBUAS56111被鑒定為短乳桿菌(L.brevis),HBUAS56117被鑒定為釀酒乳桿菌(L.cerevisiae),HBUAS56104等2株菌被鑒定為類布氏乳桿菌(L.parabuchneri),HBUAS56091等4株菌被鑒定為發酵乳桿菌(L.fermentum),HBUAS56105等8株菌被鑒定為清酒乳桿菌(L.sakei),HBUAS56094等2株菌被鑒定為副干酪乳桿菌(L.paracasei),HBUAS56092等8株菌被鑒定為棒狀乳桿菌(L.coryniformis),HBUAS56134被鑒定為腸球菌屬(Enterococcus)的乳酸腸球菌(E.lactis),HBUAS56124等17株菌被鑒定為屎腸球菌(E.faecium),HBUAS56096等5株菌被鑒定為明串珠菌屬(Leuconostoc)的腸膜明串珠菌(L.mesenteroides),部分乳酸菌分離株及其模式株的系統發育樹,如圖4所示。

圖4 部分乳酸菌分離株及其模式株構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed from partial lactic acid bacteria isolates and their model strains注:選擇分離株進行系統發育樹構建的依據為,若隸屬于某一個種的菌株數≥2株,則隨機選擇2株分離株進行系統發育樹構建,若分離株僅有1株,則該菌株直接納入系統發育樹構建

經統計分析可知,Lactobacillus為泡菜中的優勢菌屬,占分離株總數的58.62%,杜曉華[21]亦得出類似結論,其研究發現四川泡菜中的細菌以Lactobacillus為優勢菌,含量在各個樣品中普遍較高,有的甚至達到108CFU/mL。本研究中占比29.82%的E.faecium為泡菜水樣品中分離株的優勢菌種,孟令帥等[22]的研究結果與本研究相似,其通過采用傳統純培養方法分離并鑒定了辣白菜中的乳酸菌,發現在分離出的81株乳酸菌中有55.56%的分離株隸屬于E.faecium。王秋霞等[23]對自然發酵和純種發酵的大白菜泡菜在發酵過程中的乳酸菌多樣性及風味品質進行了研究,發現自然發酵泡菜中揮發性風味物質與有機酸的種類和含量較之純種發酵的泡菜更為豐富。因此,為解析五峰泡菜水樣品的品質與乳酸菌的關聯性,本研究繪制了乳酸菌分離株的熱圖,如圖5所示。

圖5 泡菜水樣品中乳酸菌分離株的熱圖Fig.5 The heatmap of lactic acid bacteria isolated from Paocai brine samples

由圖5可知,2個聚類樣品中均存在L.corynifor-mis、L.sakei和L.mesenteroides,而L.fermentum、L.plantarum、L.pentosus、L.paracasei和L.parabuchneri僅存在于聚類Ⅰ樣品中,L.brevis、L.cerevisiae、E.faecium和E.lactis僅存在于聚類Ⅱ樣品中。值得一提的是,腸球菌屬雖然可以分解蛋白質和酯類等物質,產生芳香類化合物,有利于改善食品的風味,但目前大量研究表明,腸球菌作為腸道中的一類共生菌群具有一定安全風險[24],并不建議在食品中使用。結合圖3和圖5可知,具有較好酸味和咸味品質的A4和A17樣品,其分離菌株全部隸屬于Lactobacillus;具有較好酸味品質但咸味相對較弱的A2、A10和A14樣品,其分離菌株中有88.89%隸屬于Lactobacillus,其余隸屬于Leuconostoc;在酸味上相對較弱但具有較好咸味品質的A1和A5樣品,其分離菌株中有75%隸屬于Enterococcus,其余隸屬于Lactobacillus;在酸味和咸味品質上均相對較弱的A8、A9和A13樣品,其分離菌株中Enterococcus和Lactobacillus的含量上并無較明顯的區別。HAGHSHENAS等[25]的研究表明,隸屬于Enterococcus的菌株具有雙層膜結構,使得其耐高滲透壓的能力較強[25]。羅強等[26]的研究表明,從中國北方4個不同地區傳統自然發酵泡菜樣品中分離得到的乳酸菌在pH值低于4.0的發酵液中培養24 h后約有94.9%的存活株隸屬于Lactobacillus[26]。由此可見,樣品的咸味品質表達越強,Enterococcus的含量相對增加,酸味品質表達越強,Lactobacillus的含量相對增加,造成這種現象的原因可能與不同類型乳酸菌的耐受能力不同有關。

2.5 泡菜水中乳酸菌分離株的α多樣性分析

研究進一步對2個聚類樣品中代表乳酸菌菌群多樣性的香農指數和代表乳酸菌菌群豐富度的超1指數進行了分析,構建的箱型圖如圖6所示。

a-香農指數;b-超1指數圖6 隸屬于聚類Ⅰ和聚類Ⅱ泡菜水蘊含乳酸菌分離株的多樣性分析Fig.6 The α-diversity analysis of lactic acid bacteria isolates affiliated with cluster Ⅰ and cluster Ⅱ Paocai brine samples注:NS代表差異性不顯著(P>0.05);*代表差異性顯著(P<0.05)

由圖6可知,隸屬于聚類Ⅰ和聚類Ⅱ樣品其乳酸菌類群多樣性差異不明顯(P>0.05),而聚類Ⅰ樣品的乳酸菌豐富度顯著高于聚類Ⅱ樣品(P<0.05)。結合圖3可知,隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水口感更酸,其蘊含的乳酸菌豐度也較高。通過對新、老泡菜水中乳酸菌的類群進行解析,付莎莉[27]發現老泡菜水pH值更低,其乳酸菌菌群豐度和多樣性均比新泡菜水豐富,并且群落具有較高的穩定性,受發酵環境的影響較小。由此可見,泡菜的酸度對其乳酸菌類群的構成具有明顯的影響。

3 結論

五峰土家族自治縣泡菜水樣品在滋味和風味品質上均有較大的區別,并且以酸味、乙醇和萜類物質的差異最為明顯。研究亦發現,泡菜水中乳酸菌的多樣性和豐富度均較高,并且咸味越突出的樣品中Enterococcus的含量越豐富,酸味越突出的樣品中Lactobacillus的含量越豐富。