五株雙歧桿菌胞外多糖功能特性的差異分析

王曉楠,陳拾旸,張莉杰,3,郜鑫洋,陳樹興*,茹元樸

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471023)2(鄭州科技學院 食品科學與工程學院,河南 鄭州,450064) 3(漯河食品職業學院,河南 漯河,462333)4(北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術研究中心,北京市乳品工程技術研究中心,母乳研究技術創新中心,北京,100163)

胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一類化合物。根據其組成可分為兩類,即僅由一種單糖組成的同多糖(homopolysaccharides,HoPS)和由2種或更多單糖組成的異多糖(heteropolysaccharides, HePS)。益生菌產生的EPS可通過參與物理屏障(也稱“生物膜”)的形成,對細菌提供保護,幫助其克服腸胃道極端環境,從而增強在腸道內的生存能力。此外,EPS還具有抗氧化、抗癌、降膽固醇、抗炎和免疫調節等益生功能[1]。在各種產生EPS的微生物中,雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)特定物種與乳桿菌一起被用于配制益生菌制品。雙歧桿菌是人類腸道中最主要的早期定植細菌之一,被證明具有抗腫瘤、調節血糖、降血脂、增強免疫、改善認知障礙、調節腸胃道等益生功能[2]。研究表明,雙歧桿菌分泌的EPS可能是雙歧桿菌發揮益生功能的主要分子機制之一[3]。

雙歧桿菌EPS的抗氧化能力和抑菌活性得到國內外許多專家研究和關注。XU等[4]發現從人糞便分離的B.animalisRH產生的EPS具有較強的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除活性,同時也可以增加小鼠血清中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和總抗氧化物的活性。謝瑩等[5]研究發現,雙歧桿菌BB12的EPS具有較強的還原力,并且DPPH自由基和超氧陰離子自由基的IC50均低于維生素C。WU等[6]發現,B.longumBCRC14634分泌的EPS對7種食品腐敗菌和侵染菌均有抗菌活性。體內實驗表明,通過喂養B.bifidumWBIN03產生的EPS能顯著抑制Enterobacteria、Enterococci和Bacaeroidesfragilis的生長,并且降低了小鼠腸道腸桿菌群的多樣性[7]。

雙歧桿菌分泌的EPS不僅具有良好的生物活性,還具有特殊的化學性能。雙歧桿菌EPS在水溶液中具有良好的流變特性和增稠性,劉麗莎等[8]發現添加3%動物雙歧桿菌EPS能顯著提高酸豆乳的黏度、持水性和質構特性。在LI等[9]的研究中,理化分析表明EPS在0～220 ℃具有良好的熱穩定性,可用于熱加工食品。

本研究以百歲老人腸道中分離的5株雙歧桿菌為研究對象,分離提取EPS,測定其產量并分析其化學組成、抗氧化活性和抑菌能力,采用傅里葉中遠變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)、食品流變儀和差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)測定EPS的表觀結構、耐熱性和流變性,以期為后續EPS的功能特性研究和開發益生菌胞外多糖產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

假小鏈雙歧桿菌BP-1(B.pseudocatenulatumBP-1)、長雙歧桿菌BL-3(B.longumBL-3)、動物雙歧桿菌BA-5(B.animalissubsp.lactisBA-5)、動物雙歧桿菌BA-6(B.animalissubsp.lactisBA-6)和嬰兒雙歧桿菌BI-38 (B.infantisBI-38)分離于洛陽市百歲老人腸道中,保藏于本實驗室,菌株保藏于甘油管中(-80 ℃)。

抑菌試驗指示菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、單核細胞性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)為實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養基

雙歧桿菌BS培養基(g/L):蛋白胨10,肝浸粉5,牛肉浸粉3,酵母浸粉5,胰酪蛋白胨8,可溶性淀粉0.5,氯化鈉1,磷酸氫二鉀1,磷酸二氫鉀1,葡萄糖10,MgSO4·7 H2O 0.01,MnSO40.005,L-半胱氨酸0.5,吐溫80 1 mL,pH 7.2,115 ℃滅菌30 min。

LB培養基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10,121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

吐溫80、無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、濃硫酸、NaCl、抗壞血酸、焦性沒食子酸,均為分析純,天津市德恩化學試劑有限公司;DPPH,美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

BBS-SDC型超凈工作臺,濟南鑫貝生物技術有限公司;THZ-103 B型恒溫培養搖床,上海一恒科學儀器有限公司;TA DHR-2型食品流變儀,美國Waters公司;LGJ-10 D型真空冷凍干燥機,北京四環科學儀器廠有限公司;VERTEX 70傅立葉變換中遠紅外光譜儀,德國BRUKER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養

取實驗室甘油管中凍藏的雙歧桿菌解凍,以2%(體積分數)的接種量轉接于BS液體培養基中,37 ℃ 厭氧培養48 h,繼代培養3次。

1.3.2 EPS的分離提取

將已活化的菌液按2%接種量接種于1L液體培養基中,37 ℃厭氧培養48 h,在600 nm下測定培養液的吸光度。EPS的提取參考李洋[10]的方法并進行適當的修改,即:將發酵液在4 ℃,8 000 r/min條件下離心15 min,取上清液。將上清液用旋轉蒸發儀濃縮為原體積的1/3,并加入3倍體積預冷的無水乙醇4 ℃靜置過夜。然后在4 ℃,10 000 r/min條件下離心20 min,沉淀用20 mL超純水溶解。待其溶解后加入三氯乙酸溶液至終質量分數為6%,4 ℃靜置過夜,隨后在4 ℃,10 000 r/min、離心20 min去除蛋白。將上清液裝入透析袋(MW Cut-off 14 000 Da)中放入4 ℃冰箱用蒸餾水透析48 h,每8 h換1次水,即得到胞外粗多糖,通過冷凍干燥后得到粉末狀胞外粗多糖,收集稱重。

1.3.3 化學組成的測定

EPS總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法;蛋白質含量的測定采用Bradford蛋白質染料結合法;糖醛酸含量的測定采用硫酸-咔唑法[11]。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性

采用XIAO等[12]的方法測定DPPH自由基清除活性。將1.5 mL不同質量濃度(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL)的樣品溶液與1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液充分混合。室溫避光孵育30 min后,在517 nm下測定混合物的吸光度,以抗壞血酸(維生素C)為陽性對照。DPPH自由基清除能力計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1為樣品溶液與自由基反應后的吸光度;A0為樣品溶液的吸光度,即以水代替自由基溶液,排除樣品本身吸光度對結果的影響;A2為未加樣品的吸光度,即以水代替樣品。

1.3.4.2 羥自由基清除活性

羥自由基清除活性參考LIU等[13]的方法,稍做修改。取1 mL樣品加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mol/L的水楊酸-乙醇溶液,充分混勻后,加入1 mL 8.8 mmol/L的30% (質量分數) H2O2溶液開始反應,37 ℃孵育40 min,在510 nm下測定吸光度,以維生素C為陽性對照。羥自由基清除能力按公式(1)計算。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除活性

采用曹艷華[14]的方法測定超氧陰離子自由基清除活性。將1 mL樣品與4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液充分混勻,25 ℃保溫30 min,加入0.3 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,搖勻,25 ℃反應5 min。最后向反應體系中加入1 mL 8 mol/L鹽酸以終止反應。以維生素C為陽性對照,測定反應物的OD320nm值。超氧陰離子自由基清除能力計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1為樣品溶液與自由基反應后的吸光度;A0為以水為對照的吸光度。

1.3.5 抑菌活性的測定

參考和麗等[15]的方法考察EPS的抑菌活性。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌培養至對數生長期,使用生理鹽水將菌懸液調至106CFU/mL左右備用。將100 μL菌液接種于5 mL LB培養基中,加入EPS溶液至終質量濃度為0、0.5、1、2、4、8、16 mg/mL,37 ℃, 200 r/min條件下培養12 h,測定吸光度。抑菌率計算如公式(3)所示,每組3個平行:

(3)

式中:A1為EPS組培養后的吸光度;A0為EPS濃度為0培養后的吸光度;A2為同濃度EPS溶液的吸光度(排除樣品本身吸光度對結果的影響)。

1.3.6 EPS的微觀形態觀察

取適量凍干之后的樣品,將樣品固定在掃描電鏡樣品臺上,置于離子濺射儀中鍍一層導電金膜后,對EPS 樣品的外貌形態進行觀察。

1.3.7 傅里葉變換中遠光譜的分析

將干燥的樣品與溴化鉀按質量比1∶100混合研磨,壓制成片,在400～4 000 cm-1和分辨率4 cm-1時進行掃描分析,得到各樣品的紅外光譜圖。

1.3.8 流變學特性分析

采用DHR-1流變儀測定10 mg/mL EPS溶液的流變特性。夾具采用直徑40 mm不銹鋼平板,取1 mL EPS溶液于測量板上,狹縫距離設置為1.0 mm,溫度25 ℃,剪切力0.01～300 s-1。采用穩態剪切模式測定溶液的表觀黏度隨剪切速率的變化。

1.3.9 差式掃描量熱分析

稱取3 mg干燥后的EPS樣品于鋁坩堝中,以空白坩堝為參比樣品。溫度設置為30～250 ℃,升溫速率10 ℃/min,氮氣速率100 mL/min,進行掃描檢測。

1.4 統計分析

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析,所有試驗重復3次,結果以“平均值±標準差”表示,并使用Origin 9.0.6進行相關圖標繪制。

2 結果與分析

2.1 EPS的產量與化學組成分析

不同雙歧桿菌在BS培養基上的生長情況和EPS產量如表1所示。5株雙歧桿菌在生長過程中均能分泌EPS,但產量卻不相同。其中,菌株BA-5的產量為(552.69±3.38) mg/L,顯著高于其他菌株(P<0.05);BA-5在培養48 h后,其培養液OD600nm值達到1.417±0.024,同樣高于其他菌株。此結果與熊江[16]報道的,菌株在0～48 h產胞外多糖能力與菌體生長能力呈正相關結果相一致。由表1可知,BL-3 EPS總糖含量(67.13±1.54)%高于其余4種EPS。BA-6 EPS的蛋白含量和糖醛酸含量顯著高于其他4種EPS(P<0.05)。

表1 雙歧桿菌胞外多糖的產量及化學組成Table 1 Production and chemical composition of extracellular polysaccharide from Bifidobacteria

2.2 EPS的抗氧化活性

如圖1-A所示,隨著EPS濃度的增加,DPPH自由基清除能力逐漸增強,具有一定的濃度依賴性,但是始終低于維生素C的清除能力。在質量濃度為1.8 mg/mL時,各EPS對DPPH自由基清除率達到最大,其清除能力大小為BA-6[(70.82±0.77)%]>BI-38[(68.58±1.02)%]>BP-1[(67.25±5.36)%]>BL-3[(65.71±1.54)]%>BA-5[(29.58±0.36)%]。BA-5 EPS對DPPH自由基清除能力最弱,實驗范圍內的清除率均<30%,其余4種EPS清除效果比較接近。此外本實驗清除率前4的EPS顯著高于融合魏斯氏H2 EPS在質量濃度為5 mg/mL時的清除率[17]。EPS中含有的羥基、羧基等供氫物質,使其具有一定的DPPH自由基清除能力,不同的EPS DPPH自由基清除率差異可能與糖醛酸含量、蛋白質含量和分子質量等因素有關。

如圖1-B所示,5種EPS均顯示了一定的羥自由基清除能力,無論是維生素C還是多糖組,對羥自由基的清除活性隨著濃度的增加而增加。BA-6 EPS為0.1～1.6 mg/mL時,其羥自由基清除率[(70.33±1.99)%]均高于其他樣品同濃度下的清除率。此外BA-5 EPS在1.6 mg/mL的羥自由基清除率[(59.91±2.39)%]顯著高于DPPH自由基清除率。AMIRI等[18]研究B.animalisBB12 EPS對羥自由基清除能力發現,在質量濃度為2 mg/mL時,羥自由基的清除率為(46.4±0.73)%。羥自由基是一種強氧化劑,能與生物大分子發生反應,對活細胞造成嚴重損傷,EPS中的羥基和羧基可以充當電子或氫供體,達到清除羥自由基的目的。

如圖1-C所示,隨著樣品濃度的增加,各組EPS對超氧陰離子自由基的清除能力呈現先升高后趨于平緩的趨勢。相比于其他EPS組分不足50%的清除率,BA-6的清除率達到了(67.78±0.67)%。研究表明,超氧陰離子自由基清除能力與分子中能夠促進O—H鍵釋放氫離子的親電子成分有關,如酮基、醛基等[19]。此外,本研究結果與謝瑩等[5]結果相一致,在多糖質量濃度達到0.25 mg/mL時,清除率的增加趨于平緩,猜測達到了飽和濃度。

A-EPS對DPPH自由基的清除能力;B-EPS對羥自由基的清除能力;C-EPS對超氧陰離子自由基的清除能力圖1 不同EPS對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of different EPS to DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion radical

2.3 EPS的抑菌活性

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌為指示菌,考察EPS的抑菌活性。如圖2所示,雖然不同EPS對3種指示菌株的抑制能力不同,并且低濃度EPS對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長有促進效果,但隨著EPS濃度的升高其抑制能力逐漸增強。5種EPS對于大腸桿菌的抑制并不明顯,在1 mg/mL時,BL-3、BA-5和BI-38產生的EPS對大腸桿菌的生長有促進作用,隨著濃度的增加其抑菌率也逐步增強至30%左右(圖2-A)。除了BL-3 EPS對于金黃色葡萄球菌的抑菌率只有(26.16±0.94)%,其他4種EPS對金黃色葡萄球菌的抑菌率最高可達到(57.89±0.90)%(圖2-B)。5種EPS對單增李斯特菌生長具有顯著的抑制作用,當樣品質量濃度達到16 mg/mL時,其抑菌率從高到低依次為BA-6[(94.96±1.43)%]>BA-38[(81.87±1.84)%]>BA-5[(76.21±1.19)%]>BP-1[(62.10±0.93)%]>BL-3[(60.27±0.94)%](圖2-C)。LI等[20]通過體外實驗發現B.bifidumWBIN03產生的EPS對7種病原菌的生長具有明顯的抑制作用,而對白色念珠菌Z1無抑菌作用。研究發現,雙歧桿菌EPS含有硫酸鹽基團或特定的蛋白質通過螯合剝奪細菌生長所需的營養物質,從而抑制細菌的生長,以及通過斷裂染色體DNA、抑制細菌二分裂增殖和破環生物膜等方式達到抑菌的效果[21]。

2.4 EPS的微觀形態

SEM可以顯示聚合物的表面形貌和表征聚合物的特性,5種EPS的SEM如圖3所示,BP-1和BL-3均為片狀,但BP-1表面略微凹凸不平,而BL-3表面呈現疏松多孔的形態。BA-5呈現片狀、適度分支結構,表面光滑具有光澤。BA-6內部為大量空洞的蜂窩狀結構,來自L.plantarumR040 EPS具有與本研究相似的結構,該結構有助于EPS發生填孔效應,增加對亞甲基藍染料的吸附效果[22]。BI-38為沒有孔結構的片狀且上面具有不規則的網狀結構,溝紋表面光滑,縱橫交錯呈實體狀。EPS表面微觀結構的差異,可能與多糖內單糖組成及糖苷鍵的鏈接方式等因素有關。

A-EPS對大腸桿菌的抑菌活性;B-EPS對金黃色葡萄球菌的抑菌活性;C-EPS對單增李斯特菌的抑菌活性圖2 不同EPS對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌能力Fig.2 Antimicrobial activity of different EPS against Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes

A-BP-1;B-BL-3;C-BA-5;D-BA-6;E-BI-38圖3 不同EPS的微觀結構圖Fig.3 Microstructure diagram of different EPS

2.5 傅里葉中外紅外光譜分析

圖4 不同EPS的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of different EPS

2.6 EPS的流變特性

不同EPS表觀黏度變化情況如圖5所示,EPS溶液的表觀黏度隨著剪切速率的提高(0.01～300 s-1)而降低,表現出明顯的剪切變稀行為,符合假塑性流體特征,為“非牛頓流體”。但這種結構容易被剪切應力破壞,所以,隨著剪切速率的增加,溶液黏度急劇降低,當剪切速率超過一定范圍后,體系的分子鏈形成比較穩定有序的結構,剪切速率的變化對表觀黏度造成的影響不明顯[25]。剪切速率較低時,BP-1、BL-3和BI-38 EPS的表觀黏度差異不明顯,而BA-5和BA-6 EPS溶液的表觀黏度明顯大于另外3個樣品。根據前面的化學組成分析發現,BA-5 EPS含有較高的多糖成分,BA-6 EPS的蛋白質和多糖的總含量也高于其他3 者,這或許是EPS溶液具有較高的初始表觀黏度的原因。

圖5 不同EPS溶液的表觀黏度Fig.5 Apparent viscosity of different EPS solutions

2.7 EPS的DSC分析

DSC可以用來研究高分子化合物的熱學性能及穩定性。EPS由于分子間相互作用,可形成糖鏈凝聚纏結、相互交聯的趨勢,當達到玻璃化轉變溫度(Tg)時,聚合鏈重組而產生熱作用,在DSC曲線上體現為吸熱峰[26]。5種EPS的DSC曲線如圖6所示。BP-1、BL-3、BA-5、BA-6和BI-38分別在79.5、80.5、74、80、88 ℃有強放熱峰,這可能因為玻璃化轉變導致EPS中游離/束縛水分的蒸發,說明EPS中含有大量的羧基。隨著溫度的升高至250 ℃沒有出現明顯的放熱峰,這表明EPS在30～250 ℃沒有發生氧化分解,具有良好的熱穩定性。DAZ-MONTES等[27]發現LeuconostocmesenteroidesSF3 EPS的玻璃化轉變溫度為90 ℃,EPS在熱穩定上的差異可能與分子結構、分子質量、單糖組成有關。

圖6 不同EPS溶液的DSC圖譜Fig.6 DSC spectra of different EPS solutions

3 結論

本研究以水提醇沉法對5株雙歧桿菌胞外多糖進行提取,其產量從大到小為:BA-5[(552.69±3.38) mg/L]>BL-3[(410.8±2.36) mg/L]>BA-6[(325.11±4.34) mg/L]>BI-38[(307.79±1.94) mg/L]>BP-1[(204.57±2.36) mg/L];此外,BA-6所分泌的EPS蛋白質以及糖醛酸含顯著高于其他4種EPS(P<0.05)。通過體外抗氧化試驗發現,EPS的抗氧化能力隨濃度的增加而加強,其中BA-6、BL-3、BP-1和BI-38具有顯著的DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力,此外BA-6對于超氧陰離子的清除能力顯著高于其他4種EPS。抑菌實驗發現,5種EPS對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌具有一定的抑菌效果,其中,對于單增李斯特菌具有明顯的抑制作用,并且BA-6的抑菌率高達(94.96±1.43)%。BA-6的EPS表現出較好的抗氧化能力和抑菌活性,可能因為半乳糖醛酸含量最高并且含有較多的蛋白質。5種EPS的表觀形態存在一定的差異,紅外圖譜分析發現5種EPS除了譜帶的強度外,官能團種類沒有顯著差異。流變特性的研究結果發現,BA-6和BA-5的初始表觀黏度明顯高于其他3種,此外,在30～250 ℃,5種EPS具有良好的熱穩定性。綜上,不同種雙歧桿菌EPS功能特性具有差異,并且同種不同源的雙歧桿菌菌株之間(動物雙歧桿菌BA-5和BA-6)所產EPS也存在一定的生物活性差異。動物雙歧桿菌BA-6具有較高的抗氧化能力和抑菌性能,是具有良好發展和應用前景的天然抗氧劑和食品添加劑。后續可對動物雙歧桿菌BA-6的結構進一步深入解析并探索其體內抗氧化活性功能。