植物乳桿菌微膠囊的制備工藝優(yōu)化及特性分析

要經(jīng)緯,朱含芳,黃學(xué)成,郜鑫,郭蛇,陳霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018)

植物乳桿菌常分布于各種發(fā)酵食品中,如蔬果、肉類、乳制品及葡萄酒等,同時(shí)也是人體腸道正常菌群成員,對(duì)人體健康具有促進(jìn)作用[1]。大量研究表明,植物乳桿菌能夠定植于人體腸道內(nèi),發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、緩解慢性代謝性疾病、降低膽固醇水平等多種健康功效[2]。眾所周知,益生菌發(fā)揮益生功效的前提之一是需在腸道內(nèi)達(dá)到足夠的定植數(shù)量[3]。部分植物乳桿菌穩(wěn)定性較差,進(jìn)入消化道后難以忍受胃酸、消化酶、膽汁酸等作用,限制了其益生功效的發(fā)揮。近幾年,益生菌的穩(wěn)定性和生物利用率的提高已成為功能性食品研究中的主要關(guān)注點(diǎn)之一[4]。微膠囊技術(shù)是指以天然或人工合成的高分子材料作為壁材,將固體、液體或氣體等包裹形成一種微小液滴或顆粒狀態(tài)的技術(shù),被包裹的物質(zhì)在酸性條件下耐受性提高,而在適宜環(huán)境中能夠釋放出來發(fā)揮作用[5]。

近年來,海藻酸鈉微膠囊的相關(guān)研究主要集中于微膠囊對(duì)芯材的保護(hù)、粒徑的控制以及微生物包埋率等方面,常用的制備方法有擠壓法、乳化法等[6]。李洪波等[7]采用乳化法制備干酪乳桿菌微膠囊,包埋率可達(dá)61.73%。FRAKOLAKI等[8]采用擠壓法制備海藻酸鈉雙歧桿菌微膠囊,包埋率可達(dá)到76.5%。但是,上述方法也存在一定程度的局限性,例如擠壓法制備微膠囊粒徑較大,乳化法則因攪拌速度剪切力較大,導(dǎo)致微膠囊形態(tài)不規(guī)則。采用微膠囊造粒儀制備微膠囊則可從根本解決上述問題。使用微膠囊造粒儀可在溫和條件下將微生物或動(dòng)植物細(xì)胞包埋在聚合物基質(zhì)中,形成顆粒均勻、粒徑適中的微膠囊,與擠壓法或乳化法等傳統(tǒng)制備方法相比,包埋效果穩(wěn)定高效,得到了廣泛認(rèn)可[9]。

本研究以海藻酸鈉為壁材通過微膠囊造粒儀制備植物乳桿菌IMAU10120-1微膠囊,通過檢測(cè)不同濃度海藻酸鈉、CaCl2和固化時(shí)間對(duì)植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響,優(yōu)化其制備工藝,并對(duì)所得微膠囊的腸溶性、人工胃腸液耐受性等進(jìn)行評(píng)價(jià),可為乳桿菌微膠囊的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌IMAU10120-1是經(jīng)次級(jí)感染法篩選獲得的自發(fā)突變植物乳桿菌抗噬菌體菌株,保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將植物乳桿菌IMAU10120-1以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h。連續(xù)活化3代后待用。

1.1.2 試劑

人工模擬胃液:在100 mL PBS緩沖溶液中加入0.3 g胃蛋白酶,用0.1 mol/L的HCl調(diào)整pH值為2.5,0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。

人工模擬腸液:配制0.65%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的磷酸二氫鉀溶液100 mL,使用NaOH溶液(0.1 mol/L)將此溶液的pH值調(diào)節(jié)至8.0,加入0.1 g胰蛋白酶和1.8 g的牛膽鹽,0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。

解囊劑:配制0.06 mol/L的檸檬酸鈉溶液,121 ℃滅菌15 min后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體收集

以2%的接種量將植物乳桿菌IMAU10120-1接種于MRS液體培養(yǎng)基中,經(jīng)37 ℃、18 h培養(yǎng)后,離心(4 000 r/min、5 min),菌泥用適量無菌生理鹽水重懸,制得植物乳桿菌IMAU10120-1濃縮菌懸液,使其菌體濃度約達(dá)109CFU/mL。

1. 2. 2 植物乳桿菌微膠囊的制備

把收集的菌泥和海藻酸鈉溶液按體積比1∶10混合均勻后倒入耐壓瓶中,使用微膠囊造粒儀(B-390型;步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司)經(jīng)高頻振蕩將海藻酸鈉和菌懸液的混合液體滴加到一定濃度的CaCl2溶液中,調(diào)整參數(shù)使液滴顆粒無連結(jié)且均勻,造粒結(jié)束后固化一定時(shí)間。離心得到樣品,用生理鹽水洗去微膠囊表面的CaCl2殘留液,制得成品微膠囊,置于-20 ℃保存。

1.2.3 植物乳桿菌微膠囊制備條件的優(yōu)化

1.2.3.1 海藻酸鈉濃度的優(yōu)化

選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、1.2%、1.5%、1.8%、2.0%的海藻酸鈉作為壁材,在CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,固化時(shí)間10 min的條件下制備微膠囊,測(cè)定微膠囊包埋率,確定海藻酸鈉的最佳濃度。

1.2.3.2 CaCl2濃度的確定

以最優(yōu)濃度的海藻酸鈉為壁材,CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇1%、1.5%、2%、2.5%、3%,固化時(shí)間10 min 的條件下進(jìn)行微膠囊的制備,測(cè)定微膠囊包埋率,確定CaCl2的最佳濃度。

1.2.3.3 固化時(shí)間的確定

選取最優(yōu)濃度的海藻酸鈉和CaCl2溶液,固化時(shí)間選擇10、20、30、40、50 min 進(jìn)行微膠囊制備,測(cè)定微膠囊包埋率,確定微膠囊包埋的最佳固化時(shí)間。

1.2.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上,選擇海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度以及固化時(shí)間為試驗(yàn)因素,通過正交分析法以植物乳桿菌微膠囊的包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定植物乳桿菌微膠囊的最佳制備工藝條件。

1.2.3.5 植物乳桿菌微膠囊包埋率的測(cè)定

將1 g植物乳桿菌微膠囊加入9 mL 0.06 mol/L的檸檬酸鈉溶液內(nèi),置于搖床,37 ℃、180 r/min的條件下溫育3 h后,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),包埋率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:N1為益生菌包埋后微膠囊中的總活菌數(shù)(每克微膠囊的含菌量與收集得到微膠囊總質(zhì)量的乘積);N0為包埋前的總活菌數(shù)(每毫升濃縮菌液的含菌量與濃縮菌液體積的乘積)。

1.2.4 植物乳桿菌微膠囊形態(tài)的觀察

通過光學(xué)顯微鏡觀察微膠囊的結(jié)構(gòu):取少量微膠囊分散在載玻片中央,分?jǐn)偩鶆?在光學(xué)顯微鏡100倍的條件下觀察微膠囊形態(tài)并拍照。

1.2.5 植物乳桿菌微膠囊在連續(xù)胃腸液條件的存活率

參考陳美瑄[10]的方法并加以改進(jìn):分別取1 g制備好的植物乳桿菌微膠囊和1 mL未包埋的游離菌液(空白對(duì)照)放入到9 mL的人工胃液內(nèi),在37 ℃ ,180 r/ min的條件下?lián)u床振蕩處理3 h后,測(cè)定活菌數(shù),再將微膠囊和游離菌轉(zhuǎn)入人工腸液內(nèi)繼續(xù)消化8 h 后取樣測(cè)定存活率,存活率的計(jì)算如公式(2)、公式(3)所示:

(2)

(3)

式中:N0為0 h 的活菌數(shù);N1為人工胃液處理3 h后的活菌數(shù);N2為人工腸液處理8 h后的活菌數(shù)。

1.2.6 植物乳桿菌微膠囊在人工腸液中的釋放率

參考TIAN等[11]的方法:取1 g制備好的植物乳桿菌微膠囊加入到9 mL的人工腸液內(nèi),在37 ℃、180 r/min的條件下?lián)u床溫育2. 5 h,并在0、30、60、90、120、150 min時(shí)取樣計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以上實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,所有的數(shù)據(jù)均采用8.6 Origin lab數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。并且使用IBM SPSS Statistics 20以顯著性水平為0.05進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度的確定

由圖1可知,微膠囊的包埋率隨著海藻酸鈉濃度的增加,呈先升高后降低的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)<1.8%時(shí),植物乳桿菌微膠囊的包埋率較低,原因是海藻酸鈉濃度較低,制得的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度弱,菌體容易從微膠囊內(nèi)流出[12]。當(dāng)海藻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí),包埋率達(dá)到最高(56.08%)。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)>1.8%的時(shí)候,包埋率下降14.48%,可能是由于隨著海藻酸鈉添加量的增加,溶液黏度增大,制作微膠囊時(shí)難以從噴嘴中滴落,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,壁材液密度和黏度也變大,不利于菌體的分散和包埋[13]。CHVARRI等[14]在制備雙歧桿菌微膠囊的時(shí)發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)包埋率最高(40.2%)。而本實(shí)驗(yàn)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí)包埋率最好,原因可能是由于不同制備方法造成的。本實(shí)驗(yàn)使用的微膠囊造粒儀噴嘴孔徑較小,僅有300 μm,海藻酸鈉濃度較大時(shí)黏度增加,制備過程中難以形成連續(xù)的球型液珠。綜上所述,海藻酸鈉最適添加量選擇1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖1 不同海藻酸鈉濃度對(duì)植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.1 The influence of different sodium alginate concentrations on the embedding rate of Lactobacillus plantarum microencapsules注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 CaCl2濃度的確定

由圖2可知,隨著CaCl2濃度的增加,微膠囊的包埋率呈先升高后降低的趨勢(shì)(P<0.05),當(dāng)CaCl2<2.5%時(shí),包埋率逐漸升高;當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5%時(shí),包埋率最高(62.3%);隨著CaCl2濃度的繼續(xù)升高,包埋率下降。這可能是由于,當(dāng)Ca2+濃度較低時(shí),由于沒有足夠Ca2+與海藻酸鈉結(jié)合,導(dǎo)致微膠囊機(jī)械強(qiáng)度較低,不利于菌體的包埋[15];而Ca2+濃度過高時(shí),由于海藻酸的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和,沒有多余空間與Ca2+結(jié)合。因此,CaCl2濃度過高不僅不會(huì)增加包埋率,反而會(huì)增加溶液表面張力和密度,使得擠壓出的液滴浮于表面,不易成珠[16]。周莉等[17]在制備保加利亞乳桿菌海藻酸鈉微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的時(shí)候,其包埋率最高,達(dá)78.96%;隨著Ca2+濃度的增加,微膠囊包埋率逐漸增加,但當(dāng)Ca2+濃度過高,包埋率則會(huì)有所下降,推測(cè)過高的Ca2+濃度會(huì)導(dǎo)致體系內(nèi)與壁材反應(yīng)的Ca2+相對(duì)較少,由于交聯(lián)有限導(dǎo)致包埋率下降。由圖2可知,對(duì)于植物乳桿菌IMAU10120-1,CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)包埋率最高,這可能是由于本研究使用的海藻酸鈉濃度較低,需要更多的Ca2+與海藻酸相結(jié)合。綜上所述,CaCl2的最適添加量選擇2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖2 不同CaCl2濃度對(duì)植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.2 The influence of different calcium chloride concentration on the embedding rate of Lactobacillus plantarum microencapsules

2.3 固化時(shí)間的確定

如圖3所示,隨著固化時(shí)間的增加,微膠囊包埋率呈先升高后降低的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)固化時(shí)間<40 min時(shí)微膠囊的包埋率逐漸升高,原因是海藻酸鈉與Ca2+結(jié)合不完全,微膠囊易破碎漏出菌體。當(dāng)固化時(shí)間達(dá)到40 min時(shí),其包埋率最高,達(dá)到了74.47%。而當(dāng)固化時(shí)間>40 min時(shí),包埋率下降,原因是固化時(shí)間較長可能會(huì)導(dǎo)致微生物死亡,從而導(dǎo)致包埋率下降[18]。郭宇星等[19]發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉的Na+會(huì)與CaCl2中的Ca2+發(fā)生置換形成海藻酸鈣凝膠,因此需要一定的置換反應(yīng)時(shí)間,但如果置換時(shí)間過長,交聯(lián)程度過高,小球內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密,影響基質(zhì)的傳遞,導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,因此,固化時(shí)間選擇40 min。

2.4 植物乳桿菌微膠囊的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn),選擇不同海藻酸鈉添加量(1.5%、1.8%、2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)),不同CaCl2添加量(2%、2.5%、3%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)),不同固化時(shí)間(20、30、40 min),以植物乳桿菌微膠囊的包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行正交試驗(yàn),以此篩選出植物乳桿菌微膠囊的最佳制備工藝,正交試驗(yàn)因素水平如表1 所示。

圖3 不同固化時(shí)間對(duì)植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.3 The influence of different curing times on the embedding rate of Lactobacillus plantarum microencapsules

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor of orthogonal experiment

在單因素直觀分析中,極差R越大,該因素對(duì)指標(biāo)的影響就越強(qiáng)。由表2可知,以植物乳桿菌微膠囊的包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),R值大小順序?yàn)?海藻酸鈉添加量(A)>CaCl2添加量(B)>固化時(shí)間(C)。因此,確定海藻酸鈉添加量為主要影響因素,其次是CaCl2添加量,最后是固化時(shí)間。最優(yōu)制備工藝為A2B3C3,即海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%,CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%,固化時(shí)間40 min。此時(shí)的微膠囊包埋率最高,可達(dá)到85.1%,制得的微膠囊顆粒較為均勻且無明顯黏結(jié)現(xiàn)象,因此選用上述條件為植物乳桿菌IMAU10120-1微膠囊的最佳制備工藝。

2.5 植物乳桿菌微膠囊的形態(tài)

采用B-390微膠囊造粒儀,通過調(diào)節(jié)振動(dòng)頻率和氣壓等參數(shù),可高效制備出顆粒大小適中且均勻的植物乳桿菌微膠囊。由圖4可知,植物乳桿菌微膠囊的形態(tài)大致呈球形,為白色顆粒,粒徑邊界清晰,平均粒徑在300 μm左右;凍干后的微膠囊表面不規(guī)則,但依舊維持完整外觀,無破碎裂紋等現(xiàn)象。王慶衛(wèi)[20]使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察雙歧桿菌微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn),冷凍干燥后,海藻酸鈉形成的壁殼外觀較粗糙,推測(cè)微膠囊表面具有較多孔隙,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

表2 植物乳桿菌微膠囊在不同制備條件下的包埋率Table 2 The embedding rates of Lactobacillus plantarum microencapsules under various conditions

a-凍干前的植物乳桿菌微膠囊;b-凍干后的植物乳桿菌微膠囊圖4 植物乳桿菌微膠囊的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of Lactobacillus plantarum microencapsules

2.6 植物乳桿菌微膠囊腸溶性

圖5 植物乳桿菌微膠囊在人工模擬腸液中的腸溶性Fig.5 The enterosolubility of Lactobacillus plantarum microencapsules in artificial simulated intestinal juice

2.7 植物乳桿菌微膠囊對(duì)人工胃腸液的耐受性

如表3所示,隨著微膠囊和游離菌在胃液內(nèi)處理時(shí)間的增加,兩組的活菌數(shù)均有所降低(P<0.05)。未經(jīng)包埋菌株在人工胃液處理3 h后,存活率僅有27.16%,活菌數(shù)下降了1.7×1010CFU/mL,而微膠囊組存活率為85.68%,活菌數(shù)僅下降了4.0×109CFU/mL,說明微膠囊包埋可以大大提高植物乳桿菌IMAU10120-1對(duì)胃液的耐受性。

將人工胃液處理3 h后的菌液及微膠囊轉(zhuǎn)至pH 8.0的人工腸液中繼續(xù)消化8 h后,微膠囊組的存活率仍高達(dá)79.36%,存活率僅下降6.32%;未包埋組則由于膽鹽作用,存活率從27.16%下降到16.40%,下降了10.76%。說明經(jīng)微膠囊化后,植物乳桿菌IMAU10120-1的腸液耐受性有一定提高。

RATHER等[23]將植物乳桿菌NCDC201游離菌及其微膠囊在胃液中處理90 min,游離菌下降了5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí),而微膠囊組僅下降2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。朱瑩丹[24]制備植物乳桿菌LIP-1微膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn),胃液處理90 min后,微膠囊組存活率為47.33%,未包埋組僅為16.01%,微膠囊化可對(duì)植物乳桿菌LIP-1起到較好的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)胃液處理3 h后,微膠囊組仍有80%以上的存活率。綜上所述,菌株微膠囊化后對(duì)人工模擬胃液具有一定的耐受作用。

表3 植物乳桿菌微膠囊在人工胃腸液中的存活率Table 3 The survival rate of Lactobacillus plantarum microcapsules in continuous gastrointestinal juice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉為壁材,通過B-390微膠囊造粒儀制備植物乳桿菌微膠囊,成功制備出植物乳桿菌IMAU10120-1微膠囊,其最佳制備工藝為海藻酸鈉添加量1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),CaCl2添加量3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),固化時(shí)間40 min,此條件下微膠囊包埋率最高。在不加膽鹽的人工模擬腸液處理60 min,活菌數(shù)釋放量達(dá)1.55×1010CFU/mL。在人工胃液處理3 h后,其存活率達(dá)85.68%;繼續(xù)在人工腸液處理8 h后,其存活率仍可達(dá)79.36%。本研究可為植物乳桿菌微膠囊包埋技術(shù)的開發(fā)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)和理論支持。