雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色在淋巴結檢出數量不足CRC標本脈管侵犯評估中的應用價值

凌志鋒

廣東省平遠縣人民醫院病理科 514600

近年來，生活方式的改變導致國內外結直腸癌(CRC)發病率逐漸提升，而結直腸癌切除手術開展數量逐漸增多[1]。在手術中或手術后，病理科往往需要對標本展開病理檢驗，了解腫瘤病理分期情況，以此對患者病情進行準確評估[2-3]。為對患者疾病做出臨床分期判斷，對預后進行盡早評價，在獲取CRC標本后，常規檢查中，至少需要檢出12枚淋巴結，才能對臨床分期做出判斷。然而，部分患者因年齡、化療或腫瘤發生部位的影響，無法檢出12枚淋巴結，此時對其進行分期存在一定困難[4]。脈管侵犯為惡性腫瘤遠處轉移、淋巴結轉移的必要條件，因此采用有效方法判斷有無脈管侵犯，對疾病判斷有重要價值[5]。本文選取此類標本，以對照分析方式，探索雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色在脈管侵犯評估中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2011年3月—2013年12月手術切除且確診的CRC患者標本，共116份，經檢測淋巴結檢出數量不足12枚，患者未合并其他惡性腫瘤，臨床資料完整，可隨訪，年齡29～64歲，平均年齡(59.46±2.31)歲。

1.2 方法 將本組標本均一分為二，一份行常規HE染色，一份行雙重免疫組化染色。雙重免疫組化染色：對石蠟切片進行脫蠟并水化處理，用EDTA抗原對其行20min的熱修復，阻斷內源性過氧化物酶，10min左右。根據工作濃度，將兔抗CK、鼠抗D2-40及CD34混合，制為雞尾酒抗體，也即即用型混合一抗，在37℃的盒子中，行60min孵育。用鼠抗—堿性磷酸酶、兔抗—過氧化物酶，根據一定比例進行混合，在室溫中行20min孵育。用DAB試劑行15min顯色處理，滴加AP-red試劑，行15min顯色，用蘇木精對其復染，以流水行15min沖洗，用75%乙醇對濕片組織烤干，用時10s，讓其冷卻到室溫狀態，以中性樹膠對玻片進行加蓋，封固。

1.3 判斷標準 (1)D2-40/CD34檢測顯示胞漿及包膜著色為紅色，判定是脈管；CK為胞漿著色為棕黃色，其中陽性區域含腫瘤細胞、癌旁正常上皮組織，來對脈管中癌栓加以判斷。脈管侵犯：按照Delphi法來進行判斷[6]，具體為：脈管圍繞腫瘤細胞巢50%以上，即可判定為脈管侵犯。(2)對確定脈管侵犯的標本，進一步觀察發生部位、癌細胞數量及侵犯程度，并對這些因素和患者生存期之間的關系進行分析。

2 結果

2.1 脈管侵犯評估效果 116份標本，經HE染色，顯示脈管侵犯陽性24例，檢出率20.69%；雙重免疫組化染色顯示脈管侵犯陽性48例，檢出率41.38%；兩種方法對脈管侵犯的檢出率比較差異顯著(χ2=11.600，P=0.001)。在HE染色判定為陽性的標本中，有3份標本經雙重免疫組化染色判斷為假陽性，實際是回縮裂隙。

2.2 雙重免疫組化染色的進一步分析結果 經雙重免疫組化染色判定為陽性的48份標本中，脈管侵犯的發生部位：壁內侵犯23份(47.92%)、壁外侵犯19份(39.58%)、壁內外侵犯6份(12.50%)，脈管侵犯程度：局部侵犯20份(41.67%)、中度侵犯19份(39.58%)、廣泛侵犯9份(18.75%)；癌栓細胞數≥5.5 22份(45.83%)、<5.5 26份(54.17%)。可見脈管侵犯多數為壁內侵犯，以局部侵犯最為常見，癌栓細胞數<5.5的占比較高。

2.3 預后情況分析 經隨訪，雙重免疫組化染色判定為陽性的48份標本中，患者平均生存時間為(52.36±4.18)個月；其余68份為陰性的標本中，患者平均生存時間為(82.77±6.94)個月；經對比，雙重免疫組化染色判定為陽性的患者生存時間明顯短于染色結果為陰性的患者(t=27.070，P=0.000)。

3 討論

對于CRC患者而言，對其進行TNM分期判定是評估病情、分析預后的重要措施。要想進行臨床分期判斷，就必須對手術切除的標本進行病理檢查，分析淋巴結轉移情況，然而，部分標本檢出的淋巴結數量較少，可能會導致N分期、淋巴結狀態低診斷，這就導致淋巴結檢出結果無法為術中及術后的病理判斷提供依據[7-8]。另外，即使淋巴結轉移檢查結果為陽性，也可能由于淋巴結檢查數量較少，導致分期判斷偏低，或患者無進展生存期評估有偏倚。對于這部分患者，就需要另外尋找方法，判斷患者病情，以便評估預后，提前為患者制定下一步的治療計劃[9]。

惡性腫瘤患者中，脈管侵犯是和淋巴結轉移獨立的危險因素，運用脈管侵犯評估也能在一定程度上掌握患者病情，解決淋巴結檢出數量不足這一問題。在脈管侵犯情況的常規評估中，檢驗醫師通常是借助HE染色，在光鏡下查看，然而這一操作相對復雜，且不同病理醫師獲得的結論可能有所不同，易出現分歧，這是近年來臨床亟須解決的問題。

免疫組化染色是病理檢測的常用方法之一，操作簡便，結果準確。本文中嘗試運用雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色法評估標本的脈管侵犯情況，該方法能準確區分脈管、裂隙，便于醫師識別脈管中的癌栓，同時也可將一些微小癌栓檢查出來[10]。在這一結果上獲取的半定量數據，能夠對脈管侵犯和預后之間的關聯進行預測。因此，這一方法可以用作CRC患者淋巴結檢出量不足時的補充診斷方法。本文中對116份標本實施HE染色和雙重免疫組化染色，結果發現，雙重免疫組化染色對脈管侵犯的檢出率明顯高于HE染色的檢出率(P<0.05)，說明雙重免疫組化染色在判斷脈管侵犯中的效果更為明顯。另外，雙重免疫組化染色還能對侵犯情況進行進一步分析，如本組經雙重免疫組化染色判定為陽性的48份標本中，脈管侵犯多數為壁內侵犯，以局部侵犯最為常見，癌栓細胞數<5.5的占比較高。對患者預后進行分析發現，雙重免疫組化染色判定為陽性的患者生存時間明顯短于染色結果為陰性的患者(P<0.05)，可見雙重免疫組化染色結果能夠反映CRC患者預后情況。

通過總結臨床經驗，筆者發現雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色法具有如下優勢：(1)和HE染色相比，該方法能在同一平面上對脈管和可疑癌栓組織間的關聯予以呈現；同時，應用雞尾酒抗體夠節約檢測時間，降低檢測人員的工作量，成本較低，便于推廣。(2)若CRC患者病變相對局限，應用雞尾酒抗體進行檢測，可節約標本，防止重復切片造成標本不足等問題出現。當然，該檢測方法也存在一定不足，首先將D2-40、CD34聯合應用時，在區分血管、淋巴管的過程中存在一定局限，醫師對血道轉移、淋巴道轉移難以做出預測。另外，若脈管中癌細胞數量較少，應用這一方法進行分析，醫師的判斷仍具備一定主觀性。總體來看，雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色優勢更突出。

綜上所述，在淋巴結檢出數量不足結直腸癌(CRC)標本脈管侵犯評估中，雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色能夠對脈管侵犯情況進行分析，同時可反映侵犯程度，對患者預后進行評估，值得推廣。