微RNA在異位妊娠發病機制及早期檢測中的研究進展

李珊珊，代蔭梅

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院婦科，北京 100026)

異位妊娠是指位于子宮腔外的妊娠，發病率為2%～3%[1]。由于受精卵著床位置異常，患者妊娠期間出現異常的癥狀和體征。異位妊娠可發生于多個部位[2]，其中輸卵管妊娠約占95%[1]。近年來，異位妊娠的發病率逐漸升高，若不能早診斷、早治療，可出現嚴重并發癥，威脅患者生命。因此，針對異位妊娠，尤其是輸卵管妊娠，深入研究其發病機制并進行早期診斷尤為重要。目前，異位妊娠臨床診斷多依賴于外周血妊娠相關激素水平監測和超聲檢查，但妊娠較早期超聲不能準確判斷胎囊位置，導致宮內妊娠或異位妊娠診斷困難。不僅診斷方法存在一定滯后性，異位妊娠早期診斷的標志物也較缺乏。理想的異位妊娠早期診斷標志物應具有可早期區分異位妊娠與宮內正常妊娠及先兆流產、價格適宜、取材方便、無創或微創等特點。而外周血微RNA(microRNA，miRNA/miR)即具有這些特性，因此，可通過miRNA研究異位妊娠的發病機制并探討其作為異位妊娠早期診斷標志物的可行性。現就miRNA在異位妊娠發病機制及早期檢測中的研究進展予以綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA，可通過干擾信使RNA的翻譯在轉錄后水平調節基因及多種功能相關信使RNA的表達，進而調控蛋白的表達，參與細胞的分化、增殖、代謝和凋亡[3]。研究顯示，miRNA廣泛而穩定地存在于細胞外液中[4]，因此可考慮將其作為疾病診斷的生物標志物。在哺乳動物細胞中約存在5萬種miRNA，并穩定表達于體液中，包括妊娠期母體外周血中[5]。異位妊娠早期診斷存在一定困難，鑒于miRNA的特征性優勢及其與妊娠的相關性，可考慮將miRNA作為異位妊娠的一種早期診斷標志物。

2 妊娠滋養細胞相關miRNA

2.1let7、Lin28相關miRNA

2.1.1Lin28/let7通路與妊娠 Lin28和let7最早發現于秀麗隱桿線蟲中，其中Lin28參與該線蟲的發育過程，而let7可調節秀麗隱桿線蟲的增殖、發育和分化[6]。研究發現，性早熟模型大鼠下丘腦Lin28、let7基因表達與性早熟有關[7]，因此，Lin28、let7可能與生殖系統密切相關。此外，馬薇等[8]研究顯示，Lin28在足月臨產孕婦外周血中的表達水平高于早產臨產孕婦，提示Lin28可能與胎兒生長發育相關。Canfield等[9]研究顯示，重度子癇前期患者胎盤中的Lin28低表達，表明Lin28與滋養細胞浸潤程度有關。

2.1.2let7、Lin28相關miRNA與異位妊娠 有研究者通過比較異位妊娠與正常妊娠人工流產胚胎組織中的Lin28及其相關miRNA(let-7a、miR-132、miR-145和miR-323-3p)表達水平發現，與正常妊娠相比，孕6周內異位妊娠組織中的Lin28B信使RNA水平顯著升高，let-7a、miR-323-3p水平則顯著降低[10]。由此可見，Lin28B與let-7在同一組織內相互調節并發揮作用，且可能在控制正常胎盤與異位胎盤的產生中起作用，從而參與異位妊娠的發生。但以上研究僅為組織水平且樣本量較少，同時也未比較正常妊娠與異位妊娠外周血中Lin28B與let-7表達的差異，因此能否將其作為異位妊娠早期檢測標志物仍需進一步研究驗證。

Lin28及其相關miR-323是免疫和炎癥反應的生物標志物，編碼miR-323的基因位于染色體14q32.31區域的miRNA簇中。miR-323與妊娠相關，存在于孕期母體循環中，分娩后可迅速被清除[11]。Zhao等[12]比較異位妊娠患者、自然流產患者、正常宮內妊娠者血清人絨毛膜促性腺激素、孕酮、miR-323-3p水平，結果發現miR-323-3p作為單一生物標志物的靈敏度較高，且不會隨著妊娠時限而變化。向健和王俊[13]認為，外周血miR-323-3p水平對早期異位妊娠的診斷價值顯著高于血β人絨毛膜促性腺激素48 h增長率，兩者聯合檢測的靈敏度和特異度均顯著提高。Miura等[14]研究顯示，異位妊娠患者無細胞血漿中miR-323-3p高表達，可依據其濃度區分異位妊娠與自然流產。但該研究中異位妊娠患者診斷標準不一，因此不能排除研究結果存在偏差；此外，研究未在相應妊娠部位或妊娠組織中驗證miRNA的表達差異，亦未指出具體的作用機制，均有待進一步研究明確。

2.2第19號染色體miRNA基因簇(chromosome 19 microRNA cluster，C19MC)

2.2.1C19MC與妊娠 基因簇是miRNA基因在染色體上成簇排列形成的基因群。在胎盤及未分化細胞中表達的C19MC與妊娠有關[15]。miR-517a、miR-519d和miR-525均存在于孕期母體循環中，分娩后可迅速清除[11]。miR-517a屬于C19MC中的一員，在滋養層細胞中高表達[16]；miR-517a特異性存在于胎盤發育的不同階段，并與調控胎盤發育及滋養層細胞活動的功能相一致[17]。研究發現，miR-517a在復發性流產等過程中發揮一定作用，表明miR-517a表達可影響早期胎盤發育[18]。研究還顯示，C19MC中的另一成員miR-518b也具有胎盤特異性，可作為妊娠狀態的一個指標[19]，用于預測妊娠期高血壓疾病[20]；miR-518b低表達與前置胎盤具有一定相關性[16]。miR-519d也是C19MC的成員，僅在胎盤中表達，是胎兒-母體信號轉導的重要調控因子[21]。miR-525包括miR-525-3p和miR-525-5p，參與胚胎發育、器官分化的調控，與機體的正常發育、免疫穩態以及組織損傷密切相關[22]。

2.2.2C19MC相關miRNA與異位妊娠 基于不同妊娠狀態胎盤發育的不同，相應miRNA表達會有差異，Zhao等[12]比較異位妊娠患者、自然流產患者、正常宮內妊娠者血清miR-517a、miR-519d和miR-525-3p的表達水平，結果顯示，異位妊娠和自然流產患者的miR-517a、miR-519d和miR-525-3p低表達，正常宮內妊娠者miR-517a、miR-519d和miR-525-3p的表達水平則顯著升高。Miura等[14]研究顯示，異位妊娠患者、自然流產患者、正常宮內妊娠者無細胞血漿中的miR-515-3p、miR-517a、miR-517c、miR-518b水平存在差異，且與孕周無關；進一步研究發現，無細胞血漿中的miR-517a水平差異可作為鑒別異位妊娠或自然流產患者與正常宮內妊娠者的指標，但并不能鑒別異位妊娠與自然流產患者。以上研究均表明，不良妊娠狀態(包括異位妊娠、自然流產)與正常妊娠狀態存在差異。因此，未來還需進一步探索可特異性診斷異位妊娠的相關miRNA。

2.3miR-324、miR-27b與異位妊娠 KISS-1基因定位于第1號染色體1q32～q41，參與胎盤形成、發育，其編碼的多肽是kisspeptins。KISS-1基因及其產物(轉移抑制素)均可抑制細胞的運動和增殖。研究顯示，自然流產組織中的KISS-1顯著低表達，提示其在胚胎植入和妊娠維持中具有重要作用[23]。動物實驗顯示，不同時期(發情前期/發情期)大鼠輸卵管中的KISS-1表達具有周期性變化，提示其可能在阻止胚胎在輸卵管異位種植中發揮一定作用[24]。

在正常妊娠的前3個月，循環中的kisspeptins水平逐漸升高，但在異位妊娠中kisspeptins水平則顯著降低；生物信息學預測和表達分析顯示，miR-27b-3p和miR-324-3p是妊娠<12周的人胚胎/胎盤組織中KISS-1的假定抑制因子，表明miR-27b-3p和miR-324-3p可通過下調妊娠早期階段KISS-1/kisspeptins的表達，參與異位妊娠的發生[25]。因此，kisspeptins和miR-324-3p均可作為早期妊娠期篩查的新的生物標志物。

3 抑癌基因及癌基因相關miRNA

3.1miR-21與異位妊娠 miR-21是發現較早的與腫瘤相關的miRNA，主要位于染色體17q23.2上。研究表明，miR-21在多種腫瘤細胞中高表達，參與相關基因的調控，且與腫瘤的發生密切相關[26]。同時，miR-21還與胚胎植入有關[27]。Wright等[28]研究顯示，miR-21與卵母細胞減數分裂有關，可通過改變程序性細胞死亡蛋白4的表達影響卵母細胞的成熟過程，繼而影響豬胚胎的發育。Zhao等[12]研究發現，異位妊娠患者、自然流產患者、正常宮內妊娠者無細胞血漿中miR-21水平比較差異無統計學意義，且miR-21水平與妊娠孕周無關。目前關于miR-21在異位妊娠中的研究仍較少，未來可深入研究明確其在異位妊娠中的意義及具體作用機制。

3.2miR-873、miR-223與異位妊娠 miR-873是近年發現的具有腫瘤抑制作用的miRNA，在宮頸癌組織中低表達[29]。另有研究顯示，miR-873在人子宮內膜癌組織中低表達，上調miR-873表達可抑制Ishikawa細胞的增殖和侵襲能力，發揮抑癌基因作用[30]。有學者認為，miR-873可通過直接靶向肝癌衍生生長因子在子宮內膜癌的發生發展中起抑癌作用[31]。miR-223定位于X染色體q12，參與腫瘤、免疫、炎癥等生物學過程。伴有代謝綜合征的反復妊娠丟失患者外周血miR-223低表達[32]，而亞臨床炎癥狀態、氧化應激和代謝綜合征在反復妊娠丟失的發病機制中起關鍵作用，可幫助臨床醫師預測妊娠結局。研究顯示，早發性子癇前期患者外周血miR-223表達下調，且瘦素基因是其作用的靶點[33]。

Lu等[34]通過研究宮內正常妊娠者、自然流產患者、異位妊娠患者血清中與胎盤表達有關的21個miRNA發現，其中5個miRNA(miR-218、miR-223、miR-141、miR-873和miR-323)在三組間呈差異表達，其中miR-218、miR-141和miR-323在異位妊娠患者中高表達，而miR-223、miR-873在異位妊娠患者中低表達，由此認為，miR-873可作為異位妊娠早期檢測無創、穩定的生物標志物。劉利蘭[35]研究認為，miR-873可作為異位妊娠的獨立檢測指標。但以上研究的樣本量均較小，且miR-873相應的靶基因、具體作用機制均未揭示。有研究認為，輸卵管妊娠組織中的miR-223表達上調，且其可能的作用通路是黏蛋白型O-聚糖生物合成和細胞外受體相互作用途徑，主要的靶基因包括N-乙酰氨基半乳糖基轉移酶1、Ⅰ型膠原蛋白α2和黏蛋白1[36]。以上研究結果存在差異的原因可能在于標本取材來源不同，提示miR-223在血清和妊娠組織中表達并不一致，且miR-223還可能參與人體其他生理病理過程，導致外周血循環與組織局部表達不一致，具體原因仍需進一步研究明確。

3.3miR-520a與異位妊娠 miR-520a屬于miR-520家族，具有一定抑癌基因作用[37-38]。miR-520可通過聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1依賴的DNA損傷途徑促進滋養層細胞凋亡，進而影響妊娠[39]。此外，miR-520在女性生殖器官腫瘤中亦有相似抑癌基因作用[40]。有研究通過比較孕6～8周的異位妊娠、宮內正常妊娠者、自然流產患者的miR-520a水平發現，與宮內正常妊娠者和自然流產患者相比，異位妊娠患者血漿中的miR-520a水平顯著降低，認為miR-520a可作為異位妊娠早期診斷的血清學標志物[41]。但并未明確異位妊娠的具體部位，也未進一步說明miR-520a在異位妊娠發病中的具體作用機制。

3.4miR-1247、miR-1296a與異位妊娠 miR-1247位于染色體14q32.31，具有抑癌基因作用，在腫瘤中表達下調[42-43]。miR-1296a位于染色體4q13.2，具有類似癌基因的作用，在腫瘤中的表達上調[44-45]。Zhang等[46]研究發現，與健康對照者相比，子宮內膜異位癥以外原因導致的異位妊娠患者的miR-1247表達下調、miR-1269a表達上調，且輸卵管炎性宮外孕患者miR-1247表達下調、miR-1269a表達上調更顯著；研究還發現，異位妊娠患者的miR-1247與miR-1269a表達水平呈負相關。由此認為，miR-1247和miR-1269a的異常表達可能是異位妊娠的危險因素，可考慮將miR-1247和miR-1269a作為異位妊娠的生物標志物，特別是輸卵管炎所致的異位妊娠。

4 其 他

外泌體是細胞產生的微型囊泡，含蛋白質、核酸和脂類，在細胞間通訊中起關鍵作用，可能是潛在的臨床診斷或預后生物標志物。研究顯示，胎盤外泌體參與胎盤屏障的形成[47]、母胎界面的免疫耐受[48]以及子宮螺旋動脈的重構等[49]。循環外泌體miRNA在妊娠相關并發癥中具有重要作用[50]。Sun等[51]在第一次產前檢查時提取并測定36例孕早期有腹痛或陰道出血癥狀者(16例宮內妊娠者、9例自然流產患者和11例異位妊娠患者)的血清外泌體miRNA水平，結果顯示，異位妊娠患者外泌體miR-378d水平顯著高于宮內妊娠者和自然流產患者；進一步統計分析發現，外泌體miR-378d作為異位妊娠的獨立生物標志物具有較高的靈敏度。因此，外泌體miR-378d可作為診斷早期異位妊娠的生物標志物。由于外泌體具有磷脂雙分子層膜性結構，可有效保護miRNA，并使之更穩定[52]，因此外泌體miRNA可作為異位妊娠診斷的生物標志物。

5 問題與展望

目前針對異位妊娠相關miRNA的研究多為妊娠滋養細胞異常、腫瘤細胞種植轉移相關方向等，且研究樣本量較小、標準不一，樣本來源也不一致，導致部分結果存在偏差。異位妊娠中最常見的是輸卵管妊娠，其病因主要包括輸卵管炎癥、輸卵管發育不良以及功能異常等，其中炎癥是最常見的病因[53]。與正常人群相比，輸卵管炎癥患者異位妊娠的風險增加6倍[54]。此外，輸卵管結構和功能異常也可導致輸卵管妊娠的發生。因此，可以通過輸卵管炎癥、運動功能、黏膜容受性等相關miRNA研究異位妊娠的發病機制及早期診斷標志物，如與缺氧密切相關、促進血管生成的miR-210等[55]。miRNA在循環中的水平可反映組織的生理或病理狀態，但外周血循環中妊娠相關miRNA的系統靶點目前仍不清楚。因此，未來可以通過深入研究miRNA在異位妊娠中的作用機制，探索組織與外周血中miRNA表達的一致性，尋找確切且方便易行的異位妊娠早期診斷標志物，做到早診斷、早干預，以降低異位妊娠給育齡期女性帶來的身心傷害。