誘導(dǎo)型一氧化氮合酶/一氧化氮在氣道炎癥中的研究進展

石煒弘，竇丹波，沈若冰

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)科，上海 201203)

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種具有極強生物活性的效應(yīng)分子，與人體眾多臟器功能和疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。NO在炎癥反應(yīng)中的作用機制復(fù)雜，不同酶產(chǎn)生的NO作用不一，可能同時具有抗炎和促炎作用[2]。NO由3種一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生，其中誘導(dǎo)型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在呼吸道疾病的病理狀態(tài)中廣泛表達。與其他合酶不同，iNOS催化產(chǎn)生NO的效率最高，可以達到其他合酶的1 000倍，主要分布在巨噬細胞、白細胞等炎癥細胞中，參與炎癥性疾病的病理生理過程，與炎癥關(guān)系更為密切。在炎癥反應(yīng)中NO水平升高是造成局部組織損傷的因素之一，由于iNOS在炎癥反應(yīng)發(fā)展過程中具有延遲表達和誘導(dǎo)表達的特點，炎癥反應(yīng)中NO持續(xù)產(chǎn)生，因此可通過調(diào)控iNOS活性來干預(yù)慢性炎癥性疾病的發(fā)展[3]。目前眾多實驗表明，氣道炎癥中存在iNOS表達[4-6]，但其作用機制尚無定論。現(xiàn)就iNOS/NO在氣道炎癥中的研究進展予以綜述，以為后續(xù)臨床用藥提供理論基礎(chǔ)和實驗基礎(chǔ)，也為尋找合適藥物治療氣道炎癥提供一定的依據(jù)。

1 iNOS的形成與結(jié)構(gòu)

人iNOS基因具有五核苷酸重復(fù)序列，長約37 kb，位于第17號染色體(17q11.2～17q12)[7-8]。在轉(zhuǎn)錄水平上，iNOS主要從外顯子2(包含腺嘌呤-胸腺嘧啶-鳥嘌呤起始密碼子)開始轉(zhuǎn)錄，但在細胞中其可從多個轉(zhuǎn)錄起始位點(如位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游30 bp的TATA盒)開始轉(zhuǎn)錄，這種形式在一定程度上提高了轉(zhuǎn)錄效率和容錯率[9]，同時外顯子1的可變剪接會導(dǎo)致iNOS信使RNA(messenger RNA，mRNA)起始密碼子腺嘌呤-尿嘧啶-鳥嘌呤之前的1個5′非翻譯區(qū)出現(xiàn)包含8個部分重疊的可讀框。人iNOS第27外顯子中的3′非翻譯區(qū)含有1個UUAUUAU基因序列，該序列具有易快速降解[10]和降低啟動子活性[11]的特性，目前已被證明具有不穩(wěn)定性。多轉(zhuǎn)錄起點、可變剪切加工和基因序列的不穩(wěn)定性增加了iNOS合成mRNA種類的豐富性。且iNOS基因的3′端多聚區(qū)域下游10 bp處有1個富含GT的多聚信號區(qū)也可能造成基因表達及mRNA穩(wěn)定性的差異[12]。當誘導(dǎo)合成mRNA后，由于缺乏mRNA 3′端AUUUA富含區(qū)參與mRNA降解，iNOS mRNA可以長時間翻譯、合成iNOS，不易被降解。此外，與iNOS基因表達相關(guān)的啟動因子位于5′非翻譯區(qū)3.8 kb上游，這些位于5.2～6.5 、7.2 、16 、106～115 kb等區(qū)域的啟動子均能增強iNOS的表達[13]。iNOS的表達受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，mRNA在轉(zhuǎn)錄水平不穩(wěn)定性和其他組織特性，導(dǎo)致其翻譯時與其他的NOS有較大差異。iNOS翻譯成氨基酸后，通過折疊和盤繞的方式形成二級結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域/蛋白質(zhì)。

通過蛋白結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)3種NOS的活性部位有4個區(qū)域，其中在M區(qū)域殘基差異性較大，同時M區(qū)域也是影響iNOS活性的關(guān)鍵[14]。在iNOS空間結(jié)構(gòu)上，包括3個結(jié)構(gòu)域：加氧酶結(jié)構(gòu)域(含血紅素、四氫生物蝶呤和精氨酸)、CaM識別位點和還原酶結(jié)構(gòu)域(含黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)[15-17]。目前已知人iNOS加氧酶結(jié)構(gòu)域是一種新的α-β折疊，主要由β折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)建，由血紅素、精氨酸、四氫生物蝶呤和一些NOS單體的氨基酸殘基構(gòu)成[7]。其中，血紅素利用與疏水性和脂肪族性側(cè)鏈產(chǎn)生相互作用范德華力，存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部[18]；精氨酸通過與側(cè)鏈末端結(jié)合，和堿性基、血紅素共面；四氫生物蝶呤位于蛋白質(zhì)內(nèi)部；殘基則通過一些氫鍵互相作用誘導(dǎo)突變[19]。iNOS形成空間結(jié)構(gòu)后還需要結(jié)合輔基形成二聚體才具有催化活性。研究發(fā)現(xiàn)，iNOS二聚體的底部存在未檢測到的四硫磺鋅中心，且鋅中心是所有NOS的共同特征[20]，每個單體與兩個亞基(每個亞基有1個半胱氨酸110和1個半胱氨酸115)以四面體配位方式結(jié)合，與鋅結(jié)合時凈增加8個氫鍵，有利于二聚體的穩(wěn)定[11]。

2 iNOS活性的調(diào)控

iNOS在基態(tài)下不表達，但在損傷、缺血、紫外線等因素刺激下，體內(nèi)細胞因子[如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、干擾素、脂多糖]、細菌、病毒[呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)]等可誘導(dǎo)iNOS活化，且不受細胞內(nèi)鈣離子濃度影響，這些誘導(dǎo)因子作用于啟動子/增強子和信號通路上均能不同程度地增強iNOS mRNA的表達。

iNOS mRNA啟動子有核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、干擾素調(diào)節(jié)因子1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)1α及環(huán)腺苷酸(cyclic adenylic acid，cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)等識別點，其中NF-κB主要參與基因表達調(diào)控。iNOS基因的啟動子或增強子區(qū)域有NF-κB的特異性結(jié)合位點，NF-κB活化后在轉(zhuǎn)錄水平參與iNOS基因表達調(diào)控，使iNOS mRNA迅速表達合成大量的iNOS[21]。實驗證明，炎癥因子[白細胞介素(interleukin，IL)-1、γ干擾素、TNF-α等]可通過作用于NF-κB刺激巨噬細胞產(chǎn)生大量iNOS和NO，從而參與iNOS和NO的生成調(diào)節(jié)[22]。且這些炎癥因子單獨刺激或聯(lián)合刺激均能促進NF-κB活化，有研究證實，NF-κB通路抑制劑(BAY 11-7082)能抑制這3種炎癥因子的聯(lián)合刺激，導(dǎo)致滑膜細胞產(chǎn)生iNOS和NO明顯減少，說明NF-κB對促進iNOS和NO的生成有調(diào)控作用[23]。

某些病毒也能影響NO的生成，如RSV感染后可通過上調(diào)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達生成更多NO，參與RSV感染引發(fā)的炎癥過程。研究表明，RSV感染氣道上皮細胞4 h后，核內(nèi)活性NF-κB p65蛋白、iNOS mRNA和蛋白、細胞培養(yǎng)上清液中NO水平均升高，加入NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨后NF-κB活化明顯受抑制，同時iNOS mRNA和蛋白表達下調(diào)；而相同情況下，加入NF-κB激動劑AG后，NO水平明顯升高，說明RSV感染刺激iNOS的表達，從而產(chǎn)生大量的NO。綜上表明，NF-κB活化對iNOS基因表達具有重要的正調(diào)控作用[24]。

γ干擾素和LPS在轉(zhuǎn)錄水平可誘導(dǎo)小鼠iNOS表達，如γ干擾素與其受體結(jié)合后，誘導(dǎo)STAT1磷酸化并使STAT1易位至細胞核，結(jié)合到特定序列上參與調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達，促進iNOS表達和NO產(chǎn)生[25]。γ干擾素對iNOS的誘導(dǎo)作用能通過TNF-α的分泌和NF-κB的激活被大大加強，其作用也可以被IL-4等抑制[26]。脂多糖不能直接通過活化STAT3從而調(diào)控iNOS的表達，但能間接協(xié)同γ干擾素刺激RAW264.7巨噬細胞，誘導(dǎo)細胞極化釋放IL-6和γ干擾素等激活STAT3，來進一步誘導(dǎo)巨噬細胞IL-6、TNF-α和iNOS等炎癥因子的表達，不同層級因子之間形成瀑布效應(yīng)，引起組織壞死和膿毒性休克[27-28]。

3 iNOS/NO相關(guān)信號通路與氣道炎癥

iNOS可被多種因素(如炎癥因子、細菌、病毒)誘導(dǎo)活化，調(diào)節(jié)iNOS在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達，產(chǎn)生NO，再通過激活下游的部分信號通路，如環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)-瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)、cGMP-PKG-促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、cAMP-PKA-CREB通路、NF-κB通路等促進或抑制氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。

3.1iNOS/NO-cGMP-PKG-TRPV1與氣道炎癥 iNOS/NO能通過cGMP/PKG途徑誘導(dǎo)TRPV1通道活化，促進速激肽尤其是P物質(zhì)釋放，導(dǎo)致氣道神經(jīng)源性炎癥表達[29]。TRPV1受體屬于配體門控非選擇性陽離子通道，可被多種內(nèi)源性或外源性理化因子直接激活或致敏，如辣椒素、熱、酸、內(nèi)源性大麻素等，興奮時鈣離子流動產(chǎn)生沖動[30]，在咳嗽過程中發(fā)揮重要作用。同時，TRPV1能被以NO為主的炎癥介質(zhì)降低活化閾值從而增加其敏感性[31]。

NO通過擴散作用于鄰近神經(jīng)元，或直接作用于其所在神經(jīng)元，結(jié)合到可溶性鳥苷酸環(huán)化酶上，使可溶性鳥苷酸環(huán)化酶發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)而被激活?；罨目扇苄曾B苷酸環(huán)化酶催化3，5-鳥苷三磷酸形成cGMP，cGMP通過結(jié)合PKG的兩個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的位點，激活PKG使其磷酸化?；罨蟮腜KG可磷酸化TRPV1的兩個絲氨酸殘基，從而激活TRPV1[32]。增敏后的TRPV1受到鈣離子流動引起的細胞膜去極化形成動作電位，釋放P物質(zhì)等速激肽，形成神經(jīng)源性炎癥，引起外周組織血漿蛋白外滲、血管通透性增加，組織中黏液分泌增多，繼而促進肥大細胞脫顆粒釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子，并促進中性粒細胞黏附和移行，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生細胞間黏附分子-1，激發(fā)炎癥反應(yīng)[33]。

3.2iNOS/NO-cGMP-PKG-MAPK與氣道炎癥 MAPK激活后可誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的炎癥反應(yīng)。MAPK是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其作為生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一，磷酸化級聯(lián)激活后參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)三個亞型。iNOS可通過NO-cGMP通路調(diào)節(jié)MAPK信號通路[34]。研究表明，存在于炎癥細胞中的iNOS受到外界刺激產(chǎn)生NO，NO可以激活PKG，再與MAPK上雙磷酸化位點蘇氨酸-x-酪氨酸結(jié)合活化MAPK產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，然后磷酸化下游的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)炎癥介質(zhì)的表達參與炎癥反應(yīng)[35-36]。

MAPK信號通路能加劇氣道炎癥反應(yīng)，其主要包括ERK、JNK/蛋白激酶B、p38 MAPK三種通路。其中，ERK信號通路激活能促進炎癥因子的生成和淋巴細胞、嗜酸粒細胞等大量炎癥細胞活化浸潤、趨化聚集，釋放炎癥介質(zhì)，從而參與調(diào)節(jié)氣道炎癥和氣道重構(gòu)[37]。JNK/蛋白激酶B被激活表達會加重變應(yīng)性哮喘模型小鼠的氣道炎癥[38]。同樣，p38 MAPK被激活會下調(diào)糖皮質(zhì)激素受體，抑制其磷酸化，減少糖皮質(zhì)激素受體數(shù)量，并出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象，促進炎癥反應(yīng)，降低其他藥物的抗炎效果[39]。糖皮質(zhì)激素受體是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄活化因子，通過與糖皮質(zhì)激素結(jié)合發(fā)揮治療呼吸道炎癥的作用[40]，同時反饋抑制p38 MAPK信號通路的激活，起到抗炎作用。

3.3iNOS/NO-cAMP-PKA-CREB與氣道炎癥 研究顯示，在小鼠卵母細胞體外自發(fā)成熟時，NO可能通過cAMP-PKA調(diào)控CREB參與氣道平滑肌炎癥反應(yīng)[41-42]。CREB作為轉(zhuǎn)錄增強子存在于真核細胞核內(nèi)，而NO能誘導(dǎo)cAMP活化PKA，并結(jié)合CREB最主要磷酸化位點絲氨酸133使其活化，隨后與靶基因啟動子中的CRE序列(TGACGTCA)或半序列結(jié)合，活化轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控因子CBP/p300，促進CBP/p300參與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而誘導(dǎo)CREB靶基因轉(zhuǎn)錄，減少炎癥因子的釋放，減輕氣道黏膜炎癥反應(yīng)等[43]。

由cAMP-PKA介導(dǎo)的CREB能夠作用于下游的靶基因/靶蛋白，通過下調(diào)炎癥介質(zhì)等的表達參與抑制氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生[44]。當氣道平滑肌細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時，MAPK磷酸酶-1作為CREB的靶基因，通過iNOS/NO-cAMP-PKA-CREB通路，使MAPK磷酸酶-1表達水平明顯升高，產(chǎn)生抑制炎癥的作用[42]；血紅素加氧酶-1作為血紅素降解過程的限速酶參與炎癥反應(yīng)，經(jīng)iNOS/NO-cAMP-PKA-CREB通路誘導(dǎo)表達后，能夠限制炎癥反應(yīng)和減輕組織損傷[45]。另外，還有一些靶基因/靶蛋白(RGS10[46]等)也主要通過cAMP-PKA-CREB通路發(fā)揮抑制炎癥的作用。

3.4iNOS/NO-NF-κB與氣道炎癥 NF-κB受多種誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)，其通過促進抗凋亡基因表達產(chǎn)生炎癥細胞，發(fā)揮炎癥效應(yīng)。NF-κB是初級轉(zhuǎn)錄因子，是對細胞有害刺激的第一反應(yīng)者。此外，調(diào)控因子主要在轉(zhuǎn)錄水平對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行調(diào)控，外界理化因素刺激使NF-κB抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB)激酶活化，并將細胞內(nèi)NF-κB/IκB復(fù)合物的IκB絲氨酸磷酸化，使得IκB亞基被泛素化修飾，進而被蛋白酶降解，釋放NF-κB二聚體，入核與NF-κB結(jié)合位點結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄。常態(tài)下NF-κB以無活性復(fù)合物形式存在，當它與相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活化整合后，通過發(fā)生核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)細胞增殖分化，參與機體各種炎癥和免疫反應(yīng)[47]。NO對NF-κB的調(diào)控主要表現(xiàn)為穩(wěn)定IκBα而抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性，從而降低下游靶基因的表達，發(fā)揮抗炎作用。

研究表明，氣道炎癥初始階段炎癥因子引起NF-κB活化，導(dǎo)致iNOS基因表達而使NO生成增多[48]，此時低濃度NO與炎癥因子通過刺激IκBα表達入核，進一步加強NF-κB活化，使其靶基因大量表達，炎癥進一步發(fā)展。同時產(chǎn)生的過多NO又能負反饋作用于NF-κB抑制其活性，使靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，NO及炎癥因子生成減少，發(fā)揮抑制炎癥發(fā)展過程的作用。

4 iNOS/NO與氣道炎癥相關(guān)的肺組織纖維化、氣道高反應(yīng)

iNOS/NO與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展有明確的相關(guān)性。當發(fā)生氣道炎癥時，氣道上皮細胞作為氣道的第一道細胞屏障，受到炎癥因子的反復(fù)刺激可以造成氣道上皮細胞的慢性損傷和再修復(fù)，導(dǎo)致上皮細胞分泌大量促炎因子、生長因子及重構(gòu)細胞因子，進一步形成肺組織纖維化、氣道高反應(yīng)等其他肺部病理變化[49]。

肺組織纖維化是由于肺纖維細胞受到破壞時，肺間質(zhì)會分泌膠原蛋白進行過度修補，從而形成炎癥反應(yīng)、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和肺實質(zhì)損傷等病理狀態(tài)，而iNOS在肺纖維化過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。在炎癥因子誘導(dǎo)下，肺巨噬細胞和成纖維細胞中出現(xiàn)iNOS蛋白的過表達會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進肺內(nèi)氧化損傷，導(dǎo)致肺組織纖維化產(chǎn)生。其中肺巨噬細胞能促進成纖維細胞增殖，而成纖維細胞與膠原的合成密切相關(guān)[50]。文獻報道，iNOS阻斷劑AG會抑制iNOS合成NO，同時會抑制炎癥細胞的浸潤，減少肺間質(zhì)內(nèi)膠原纖維數(shù)量，抑制纖維化的形成[51]。

研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞的形態(tài)與細胞內(nèi)iNOS表達的變化有關(guān)[52]。肺纖維化損傷初期，iNOS表達較強，成纖維細胞胞質(zhì)豐富，而損傷晚期iNOS表達較弱，成纖維細胞形態(tài)變成長梭形。因此通過抑制iNOS表達，可起到緩解肺組織纖維化的作用，推斷通過觀察成纖維細胞形態(tài)的變化，可以判斷抑制劑的作用時期。

氣道高反應(yīng)主要表現(xiàn)為在受到外界刺激時過早或過強烈的氣道收縮，導(dǎo)致支氣管明顯狹窄的一種病理變化。而iNOS也參與這一過程，iNOS產(chǎn)生大量 NO，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促使輔助性T細胞2活化，導(dǎo)致血管擴張、通透性增加、血漿外滲，嗜酸粒細胞浸潤，促進炎癥因子(如IL-4、IL-5)的表達，加重氣道炎癥，從而導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高、支氣管收縮等。同時有研究表明，iNOS可以通過激發(fā)ERK1/2和JNK1/2磷酸化表達，促進炎癥因子(如IL-6、IL-8及TNF-α)的產(chǎn)生，增加氣道嗜酸粒細胞募集、黏液高分泌，從而產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性[53]。因此，抑制iNOS/NO在炎癥中的表達能夠在一定程度上起到治療和預(yù)防肺部疾病發(fā)生發(fā)展的作用。

5 結(jié) 語

iNOS通過效應(yīng)分子NO發(fā)揮生物學(xué)作用，在生理病理下具有促炎和抗炎雙重效應(yīng)。氣道慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程可能與iNOS/NO介導(dǎo)的過度炎癥相關(guān)，其促炎作用主要表現(xiàn)為通過cGMP-PKG、MAPK和NF-κB等信號通路和其他炎癥信號通路形成炎癥網(wǎng)絡(luò)，促進炎癥因子表達和組織病理損傷。故推測，當iNOS/NO起促炎作用時炎癥過程中其他物質(zhì)抑制抗炎因子的表達或抗炎作用過弱被掩蓋，說明iNOS在氣道炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵和推進作用。因此，iNOS作為NOS之一，可能是目前研究NO促炎作用比較合適的靶點之一?？梢姡瑢ふ疫x擇性iNOS抑制劑干擾上述不同信號途徑以抑制iNOS表達，起到治療氣道炎癥性疾病的作用具有重要意義，未來需進一步探索。