細胞自噬與PI3K/Akt/mTOR信號通路在黑色素瘤耐藥性中的研究進展

秦文欣，王永晨

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院皮膚性病科，哈爾濱 150086)

黑色素瘤又稱黑素瘤，是一種起源于黑色素細胞的惡性腫瘤[1-2]，可發生于黑色素細胞存在的部位，常見于皮膚，亦可見于皮膚黏膜，具有侵襲性強、惡性程度高、預后差、易發生轉移、對放化療不敏感等特征[3-4]。近年來，黑色素瘤的發病率和病死率呈持續升高趨勢。2019年，美國確診新發黑色素瘤患者約96 480例，因黑色素瘤死亡約7 230例[5]。近年我國黑色素瘤患者也逐漸增多，黑色素瘤已經成為嚴重威脅我國人民生命健康的疾病之一[6]。研究表明，黑色素瘤的發生與黑色素細胞內的多種基因突變密切相關，其中v-raf鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因突變率較高，一半以上的晚期黑色素瘤患者體內存在BRAF基因第600位的突變[7]。我國皮膚黑色素瘤患者也存在BRAF基因突變，且主要以第600位的突變為主[8]。針對突變BRAF基因的靶向藥物包括威羅菲尼及達拉菲尼，其用于黑色素瘤治療取得了顯著進展，對于已經發生轉移且無法行手術治療的患者，基因靶向治療起效快，患者遠期生存率高，但靶向藥物治療后，大多數患者很快產生耐藥[9-10]。現就細胞自噬及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路對黑色素瘤可能產生耐藥性的分子機制進行綜述，以期為黑色素瘤耐藥性的研究提供幫助。

1 黑色素瘤對基因靶向藥物產生耐藥

黑色素瘤的發生、侵襲、轉移與細胞癌基因BRAF的突變激活密切相關[11]。目前檢測到BRAF突變已逾30種，突變常發生在核酸序列第600位上，導致編碼的纈氨酸突變成谷氨酸，即BRAF V600E突變，占80%以上。BRAF基因屬于RAF家族，可編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶。此外，BRAF基因還負責細胞內的信號轉導，指導細胞正常的生長、增殖、分化和生存。BRAF基因突變可導致細胞的生長、增殖、分化和代謝的改變。因此，發生BRAF V600E突變黑色素瘤患者的治療反應較差、生存率低。鑒于以上問題，針對 BRAF V600E突變靶位的靶向藥物相繼問世，如威羅菲尼和達拉菲尼已被批準用于臨床黑色素瘤的治療[12]。這些靶向藥物的使用在黑色素瘤患者的治療中取得了重大突破。BRAF抑制劑可抑制促分裂原活化的蛋白激酶信號通路的異常激活，進而抑制黑色素瘤的增殖、轉移及侵襲。在使用BRAF抑制劑治療的早期試驗中，靶向藥物可通過刺激適應證患者的免疫能力，使黑色素瘤的瘤體迅速縮小。然而，大多數患者的療效持續時間較短，黑色素瘤細胞很快對靶向藥物產生耐藥，耐藥性的產生在很大程度上降低了黑色素瘤細胞對藥物的敏感性，故黑色素瘤重新生長。因此，揭示BRAF抑制劑的耐藥性機制并解決BRAF抑制劑的耐藥問題，成為治療BRAF V600E突變黑色素瘤亟待解決的問題。

2 細胞自噬與黑色素瘤耐藥的相關性

近年來，細胞自噬在黑色素瘤的發病機制和治療中的作用受到廣泛關注，細胞自噬水平升高可能維持黑色素瘤細胞的活力并導致其耐藥性產生，而對細胞自噬的深入研究有助于更好地理解黑色素瘤的發病機制及耐藥的相關性。

2.1細胞自噬 細胞自噬是細胞內一種重要的生物代謝途徑，其進化過程高度保守。細胞自噬通過溶酶體降解自身的細胞內容物，屬于溶酶體降解途徑。機體通過細胞自噬對細胞內廢棄或受損的生物大分子及細胞器進行清除、降解以及回收利用，細胞自噬的存在有利于細胞內成分的循環利用，對維持細胞內穩態有重要作用[13-14]。細胞自噬可以“基礎性細胞自噬”和“誘導性細胞自噬”兩種不同形式被激活[15]。在生理條件下，“基礎性細胞自噬”作為細胞內質量控制途徑發揮作用，有利于細胞質成分的周轉；“誘導性細胞自噬”通常在一些不利條件下被激活，當細胞的營養和生長因子被剝奪、病原體感染和能量消耗時，為滿足細胞應激期間的營養需求，“誘導性細胞自噬”常被激活。“基礎”和“誘導”類型的細胞自噬對于維持細胞存活和體內平衡至關重要。在哺乳動物中，細胞自噬的發生途徑為伴侶介導的自噬、微自噬、巨自噬3種，其中巨自噬與黑色素瘤的關系更為密切，下文所述自噬均為巨自噬。

2.2細胞自噬在腫瘤形成過程中的不同作用 自噬在腫瘤中的作用高度復雜，且尚有爭議[16]。自噬在腫瘤形成過程中的作用具有兩面性，既可發揮促進作用，又可發揮抑制作用[14]。“基礎性細胞自噬”對早期腫瘤細胞有抑制作用[17]。在早期腫瘤細胞內，自噬通過穩定細胞內的基因序列保護基因組免受傷害，從而減少腫瘤細胞的產生與發展。當腫瘤細胞內自噬水平過高時，自噬性細胞死亡以非依賴性細胞凋亡方式抑制腫瘤細胞的增殖，且自噬不僅可為T細胞免疫反應提供能量，還可影響抗原交叉呈遞，且自噬小體是腫瘤抗原的有效載體之一，有利于早期腫瘤細胞的清除。“誘導性細胞自噬”對晚期腫瘤細胞有促進作用。在晚期腫瘤細胞內，自噬可增強腫瘤細胞的抗凋亡能力，當腫瘤細胞處于乏氧、饑餓、感染、物理損傷等不良環境時，細胞內自噬激活、耐受力增強，這有助于維持細胞穩定[14]。當手術、放療及化療時，“誘導性細胞自噬”通過促進腫瘤細胞的自身休眠引發治療抵抗，這是腫瘤復發和遠處轉移的原因之一[18]。綜上，在腫瘤發生早期階段，自噬可能有助于控制或殺死癌細胞，而對于已經發展的晚期腫瘤細胞，抑制自噬可以阻斷其促進腫瘤的作用。

2.3細胞自噬可增加黑色素瘤細胞的耐藥性 在惡性黑色素瘤細胞中，自噬的上調可能增加其耐藥性。研究報道，有些已經癌變的細胞可以利用“誘導性細胞自噬”的保護作用避免因藥物和電離輻射等治療造成的傷害，使癌變細胞產生耐藥性，甚至導致腫瘤復發[18]。在黑色素瘤小鼠模型中，自噬相關蛋白5的雜合缺失增強了黑色素瘤對BRAF抑制劑達拉菲尼的有效反應[19]，因此自噬抑制劑被認為是一種提高黑色素瘤細胞對治療敏感性的有效策略。在使用BRAF抑制劑單獨治療或聯合促分裂原活化的蛋白激酶激酶抑制劑治療的黑色素瘤患者中，有74%的患者自噬水平增高，聯合使用自噬抑制劑后，黑色素瘤患者對BRAF抑制劑的藥物敏感性提高；此外，還可通過抑制自噬相關基因Beclin1靶向抑制自噬，使自然殺傷細胞滲入黑色素瘤，以提高化療效果、增強腫瘤的免疫反應[15]。M?ller等[20]發現，抑制自噬可抑制黑色素瘤的病程進展。對移植黑色素瘤細胞小鼠的實驗研究發現，黑色素瘤細胞的自噬水平越高，移植組織的致瘤性和侵襲性越強，而抑制自噬則可提高黑色素瘤細胞對治療的敏感性，使黑色素瘤細胞重新發生凋亡[21]。

2.4細胞自噬可促進黑色素瘤細胞的轉移 黑色素瘤中存在自噬，且自噬在黑色素瘤的轉移及發展中起重要作用[17]。當自噬發生時，胞質分散型微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅰ會轉化為膜結合型LC3-Ⅱ，因此LC3常作為檢測自噬活性的標志蛋白，其相對表達量可大致反映自噬水平。Lazova等[22]對皮膚組織進行免疫組織化學染色并觀察自噬標志物LC3抗體的實驗顯示，正常皮膚組織中黑色素細胞內染色不明顯，而只發生皮膚播散型黑色素瘤組織細胞的LC3抗體染色明顯。此外，氯喹作為一種溶酶體藥物和自噬抑制劑作用于黑色素瘤細胞，可誘導自發性黑色素瘤細胞死亡并減少轉移性黑色素瘤細胞的克隆增殖[15]。

3 PI3K/Akt/mTOR信號通路與黑色素瘤耐藥的相關性

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛參與調控細胞增殖、凋亡以及細胞周期等生理病理活動，該通路的失調與黑色素瘤的發生發展密切相關[23]。PI3K/Akt/mTOR信號通路可通過減少黑色素瘤細胞中凋亡發生的程序觸發另一種細胞生存途徑，使黑色素瘤對BRAF抑制劑產生耐藥。因此，深入探討PI3K/Akt/mTOR信號通路有助于全面了解黑色素瘤耐藥的原因。

3.1PI3K/Akt/mTOR信號通路

3.1.1PI3K PI3K是一種脂質激酶，廣泛分布于多種哺乳動物的細胞質中，并作為PI3K/Akt/mTOR信號通路的起始因子以及傳遞細胞間信息和調節胞質內囊泡運輸的信使[24]。目前已發現3種不同類別的PI3K，根據作用底物不同可將其劃分為 3個亞型[25]：PI3KⅠ、PI3KⅡ、PI3KⅢ。PI3KⅠ是由兩種不同亞基(p110催化亞基、p85調節亞基)所構成的異源二聚體，其在細胞內較為活躍，可將膜結合的磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸轉化成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸。磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸被認為是觸發募集和激活激酶的二級信使，其受到人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的調節而發生去磷酸化，導致磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸活躍持續時間減少。PI3KⅡ和PI3KⅢ可調節細胞內物質循環和自噬途徑中的膜運輸[26-27]，間接影響細胞信號轉導。

3.1.2Akt Akt是由反轉錄病毒安基因V-Akt基因編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是PI3K下游離子靶向電位調節中的關鍵分子之一，在細胞存活和凋亡中起重要作用。當Akt的T308和S473殘基被磷酸化時，Akt被完全激活。活化的Akt可以磷酸化多種酶，包括胱天蛋白酶9等[28]。目前已發現3種Akt家族成員[Akt1、Akt2、Akt3(又稱PKBα、PKBβ、PKBγ)]均參與下游底物的活化過程，但在不同的細胞環境中，上述Akt家族成員的功能存在差異[29-30]。Akt1廣泛分布于組織細胞中，可調控細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程。Akt2主要分布在肌肉和脂肪細胞中，在人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因功能缺失的前列腺癌細胞中發揮作用。Akt3在大腦和睪丸中表達較多，參與細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成、糖原合成和葡萄糖攝取等生物學過程。

3.1.3mTOR mTOR是PI3K/Akt的下游激酶，屬于PI3K相關激酶家族成員之一。mTOR是PI3K/Akt/mTOR信號通路的免疫調節物質及能量代謝控制中心[31]。mTOR可分為mTOR復合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2兩種類型，其中mTORC1在PI3K/Akt/mTOR信號通路中發揮主要作用。mTORC1對雷帕霉素的敏感性高，而mTORC2對雷帕霉素不敏感。mTORC1受激素、生長因子、營養物質和細胞應激等各種環境信號所調節，通過增加蛋白質的生物合成來影響細胞的生長和存活。此外，mTORC1還參與了細胞骨架組織的調節，可通過Akt的磷酸化和激活在細胞增殖的調節中發揮作用，但mTORC2的確切作用尚不完全明確[25]。當營養豐富時，mTOR信號被激活，蛋白合成增加，細胞體積增加；當營養不足時，mTOR信號被抑制，能量消耗和蛋白合成減少[32]。

3.2PI3K/Akt/mTOR信號通路可調節細胞自噬 自噬產生的調節機制非常復雜。mTOR是多條調節細胞自噬信號通路的重要聚合點，是產生自噬過程的核心因素，可負性調節自噬的發生[32-33]。在mTOR上游主要有兩條信號通路具有激活mTOR的作用，即PI3K/Akt信號通路和Raf/促分裂原活化的蛋白激酶激酶/胞外信號調節激酶信號通路。細胞自噬主要受PI3K/Akt信號通路的調節[19]。PI3K是mTOR的上游激活劑，通過磷酸化下游重要的信號轉導分子Akt調控mTOR，mTOR可通過Akt直接或間接磷酸化而被激活，磷酸化后被激活的mTOR可抑制自噬的發生[34-35]。mTOR可通過多種途徑影響自噬途徑[36]：①通過增強4E結合蛋白-1的磷酸化，使其與真核細胞翻譯起始因子4E分離，從而抑制自噬。②從Unc-51樣激酶1復合物上解離的mTOR通過防止Unc-51樣激酶1的外源活化，促進Unc-51樣激酶1自身活化FIP200和自噬相關蛋白13，減少自噬泡形成，進而抑制自噬。③死亡相關蛋白1作為mTOR的作用底物，可抑制自噬。④mTOR可通過調控Ambra1(autophagy/Beclin 1 regulator 1)的磷酸化抑制自噬的活性。

3.3PI3K/Akt/mTOR信號通路在黑色素瘤耐藥性中的作用 抑制自噬上游負性調控的PI3K/Akt/mTOR信號通路后，黑色素瘤細胞內的自噬水平明顯升高，黑色素瘤細胞凋亡明顯減弱，黑色素瘤細胞對藥物抵抗性明顯增強[37]。在BRAF抑制劑治療早期，BRAF突變黑色素瘤細胞對藥物治療反應良好，腫瘤細胞的生長、增殖、分化受到抑制，瘤體有所縮小，患者狀態有所改善，但大部分患者于治療約6個月時出現耐藥[38-39]。細胞內的PI3K/Akt/mTOR信號通路負性調節細胞自噬，故推測，在BRAF抑制劑治療一段時間后，由于黑色素瘤細胞內PI3K/Akt/mTOR信號通路長期受到影響，其持續的低水平表達可能促進了細胞自噬水平的上調蓄積，而黑色素瘤細胞通過這種“誘導”自噬獲取了較多的胞內營養支持，使其對基因靶向藥物的耐受性增加，抗細胞凋亡能力增強，導致黑色素瘤耐藥性的發生。

4 小 結

黑色素瘤惡性程度高，可選擇的治療方法有限，且黑色素瘤細胞廣泛的耐藥性導致治療效果欠佳，患者生存率較低。因此，亟須更好地了解黑色素瘤細胞產生耐藥性的分子機制，以促進黑色素瘤治療的進展。黑色素瘤細胞產生耐藥性的分子機制目前尚不完全明確。黑色素瘤對基因靶向藥物BRAF抑制劑產生耐藥可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路及細胞自噬相關，隨著研究的不斷深入，對黑色素瘤產生耐藥性的分子機制的認識將逐漸明確，這將為未來黑色素瘤的治療提供很大幫助。