色譜質譜聯用技術在T2DM發生發展、中醫證候相關生物標志物及中藥代謝通路識別中的應用進展

李娜芬，陳學勤

1 福建中醫藥大學附屬廈門中醫院內分泌科，福建 廈門 361001；2 福建中醫藥大學第一臨床醫學院；3 廈門大學附屬第一醫院中醫科

2型糖尿病（T2DM）是一種代謝紊亂的慢性高血糖疾病，其特征在于糖類、脂質和蛋白質代謝的改變。據國際糖尿病聯合會IDF最新發布的全球糖尿病地圖（第10版）顯示：目前有5.37億成年糖尿病患者，其中有2.4億為未診斷的糖尿病（44.7%），絕大多數為T2DM。在我國T2DM占糖尿病人群的90%以上［1］。除了極高的發病率和漏診率，T2DM還會導致多種并發癥，如糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變及糖尿病周圍神經病變等［2-5］，已經成為嚴重威脅人民健康的公共衛生問題。在T2DM的發生發展過程中，患者體內往往出現一系列復雜的代謝變化，以往對于T2DM的研究方法主要以系統生物學和生物化學為主，忽視了患者體內整體代謝水平的變化。代謝組學技術可以對生物體內所有的內源性小分子（MW＜1 000 Da）代謝產物進行定性和定量分析，將代謝產物的動態變化與生理病理相關聯［6］，目前已廣泛應用于心血管疾病、腎病、腫瘤等領域的研究［7-9］。常用的代謝組學技術包括：液相色譜-質譜（LC-MS）、高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）、氣相色譜-質譜（GC-MS）、核磁共振氫譜（IH-NMR）。不同的代謝組學技術特點各異，因此要根據不同的實驗目的選擇相宜的技術。IH-NMR技術可以檢測含有碳、氮或氧的化合物，具有前處理簡便性、無損傷性、無偏向性等優勢，但其靈敏度低、檢測動態范圍窄、檢測的化合物數量有限。質譜技術具有較高的專屬性及靈敏度，可以同時快速檢測和分析多種化合物，有效地解析樣本中的化合物成分；色譜技術具有超高的分離能力，配合質譜的高靈敏度及強特異性的特點，色譜質譜聯用技術在代謝組學研究中被廣泛應用［10］。近年，色譜質譜聯用技術在T2DM的相關性研究中被廣泛應用，且取得不少研究成果，現就色譜質譜聯用技術在T2DM發生發展早期、不同中醫證候生物標志物及中藥代謝通路識別中的應用進展進行以下綜述。

1 色譜質譜聯用技術在T2DM發生發展相關生物標志物識別中的應用

T2DM是一個慢性發展的過程，從臨床癥狀的出現到生化指標的異常，再到相關并發癥的發生，往往涉及多種代謝紊亂。通過色譜質譜聯用技術可以了解患者體內代謝物的異常特征，識別T2DM發生發展過程中的潛在生物標志物，有利于進一步認識T2DM的生理病理機制。既為臨床診斷提供新途徑，也利于指導臨床及早介入干預手段、控制疾病發展。

1.1 色譜質譜聯用技術對T2DM發生相關生物標志物的識別T2DM的發生涉及糖類、脂質、氨基酸等代謝途徑的紊亂。當患者出現臨床癥狀或生化指標出現異常時，糖尿病可能已經存在很長時間了，故尋找反映其發生變化的潛在生物標志物可以作為本病的早期診斷指標。LONG等［11］采用超高效液相色譜—高分辨質譜（UPLC-HRMS）技術對空腹血糖受損患者的血清進行代謝組學研究，發現了23種有差異的代謝產物，其中2-乙酰乳酸、2-羥基-2，4-戊二酸鹽、l-谷氨酰胺和l-阿拉伯糖水平與空腹血糖受損具有顯著的相關性。肖繼等［12］基于HPLC-MS的代謝組學方法分析糖耐量異常患者的血清代謝產物，發現甘氨酸、賴氨酸和反式肉桂酸水平相對于健康人均呈下降趨勢，可能是T2DM前期的潛在生物標志物。寧萌等［13］采用HPLC-MS技術對初發T2DM大鼠模型的血清樣本進行代謝組學研究，發現乳酸、尿素、甘油、L-異亮氨酸、L-絲氨酸等含量顯著上升，而氨基丙酸、β-羥基丁酸、磷酸、蘇氨酸、甘油酸等含量降低，并隨著病情發展而產生明顯變化，可作為T2DM早期診斷的潛在生物標志物。PORCU等［14］基于人群列隊的縱向數據和2樣本孟德爾隨機化（MR）的研究揭示了纈氨酸、亮氨酸、肉堿、谷氨酸、丙氨酸、甜菜堿、賴氨酸、甘露等代謝產物的反向因果效應，表明T2DM的遺傳易感性可能觸發這些代謝產物的早期變化，可作為T2DM早期研究的微代謝指標。谷艷等［15］采用GC-MS技術對T2DM患者的血清代謝物譜進行分析，發現葡萄糖、半乳糖、甘油、游離脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）、纈氨酸及其代謝物2-酮戊二酸、亮氨酸、異亮氨酸及其代謝物2-酮異己酸濃度顯著升高，而甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的濃度顯著降低。一項基于LC-MS技術的病例對照研究［16］通過對泰國T2DM患者的氨基酸譜進行分離、鑒定和評估，證實了血漿谷氨酸濃度與T2DM的發生獨立相關。

以上研究表明，從糖尿病前期到T2DM的發生，通過色譜質譜聯用技術均可檢測多種有差異的生物標志物，這些有差異的生物標志物可以預測人們患T2DM的風險趨勢，為臨床早期診斷提供新途徑。此外，全方位的代謝譜分析還可以指導臨床對無癥狀的個體進行早期干預手段的介入，實現早發現、早診斷、早治療。

1.2 色譜質譜聯用技術對T2DM并發癥發生相關生物標志物的識別T2DM后期可引起的一系列慢性并發癥，正是這些慢性并發癥導致T2DM致殘率及病死率增加。由于早期臨床癥狀不明顯，很難對其進行早期干預。目前多依賴于患者自覺定期體檢篩查，但具有很高的漏診率。“既病防變”，尋找可以預測T2DM發展的生物標志物，早期干預，對于控制疾病發展具有重大意義。

TAN等［17］采用LC-MS技術對糖尿病腎病患者的血漿進行代謝組學研究，發現谷氨酰胺、苯乙酰谷氨酰胺、3-氨氧基硫酸、乙酰苯丙氨酸、黃嘌呤、二甲基尿酸和不對稱二甲基精氨酸等代謝產物水平明顯增加。SHAO等［18］則基于氣相色譜儀結合飛行時間質譜（GC-TOFMS）代謝組學方法分析糖尿病腎病患者的尿液，發現了9種有差異的代謝產物，主要涉及12種代謝途徑，其中4-羥基苯甲酸、腺苷、1-阿拉伯糖、1-天冬氨酸及加拉基酸可作為糖尿病腎病的潛在生物標志物。朱曉蓉等［19］基于LC-MS代謝組學方法分析增殖期糖尿病視網膜病變患者的血清，發現137種有差異的代謝產物，主要涉及硫代謝、鞘脂代謝、半胱氨酸以及蛋氨酸代謝通路。SUN等［20］采用超高性能液體-Q-Exactive-質譜（UPLC-QE-MS）技術分析糖尿病視網膜病變患者的血漿，發現了22種屬于不同代謝途徑的代謝產物，認為假尿苷、谷氨酸鹽、亮氨酰、亮氨酸和N-乙酰色氨酸可能是糖尿病視網膜病變的特異性生物標志物。任繁棟等［21］采用超高效液相色譜—高分辨質譜（UPLC-HRMS）技術對T2DM合并冠心病患者的血漿進行代謝組學研究，發現了37種有差異的代謝產物，認為脂肪酸代謝在T2DM合并冠心病患者的代謝紊亂中起重要作用。

近年研究［22-25］表明，在DM進展過程中也會影響腦代謝，最終導致糖尿病中樞神經系統的相關代謝紊亂。糖尿病腦病是指糖尿病引起的認知障礙和大腦的神經生理及結構改變，特別是阿爾茨海默病（AD）和抑郁癥［26-28］。CHEN等［29］基于LC-MS代謝組學方法分析糖尿病伴輕度認知障礙大鼠模型的血清，發現了94種差異表達的內源性代謝產物，主要參與鞘脂代謝、色氨酸代謝、甘油磷脂代謝，認為血清中的PE、PC、L-色氨酸和1-磷酸鞘氨醇可作為糖尿病伴輕度認知障礙早期診斷的關鍵生物標志物。SONG等［30］采用超高效液相色譜四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q/TOF-MS）技術分析糖尿病認知功能障礙前期小鼠模型的尿液，認為C8H9N、5-羥基-l-色氨酸、煙酰胺、惰性乙醛、鞘氨酸、焦谷氨酸和n-乳酰纈氨酸可作為糖尿病認知功能障礙的早期生物標志物。一項對來自巴爾的摩衰老縱向研究和尸檢隊列的腦組織樣本進行定量和靶向代謝組學的研究發現，鞘脂代謝的紊亂與尸檢時AD病理學的嚴重程度及前驅期和臨床前階段的AD進展相關，認為鞘脂類可能是AD早期的潛在生物標志物，糾正鞘脂代謝紊亂可作為AD新的治療策略。

由上，我們可以看到無論是糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變還是糖尿病腦病等，通過色譜質譜聯用技術均可以識別與之相關的潛在生物標志物。由于T2DM的預后取決于其并發癥的發展，故控制并發癥的發展在T2DM的診療中至關重要。但臨床上大多關注患者血糖情況，往往忽略T2DM后期引起的一系列慢性并發癥。通過色譜質譜聯用技術可以鑒定T2DM并發癥發展過程中的潛在生物標志物，這些生物標志物不僅可以輔助疾病進行分級診斷，還可以指導臨床進行早期干預、控制疾病發生，從而降低致殘率及病死率。

2 色譜質譜聯用技術在T2DM不同中醫證候生物標志物及T2DM相關中藥代謝通路識別中的應用

中醫學作為現代醫學的重要組成部分，在T2DM的治療中具有舉足輕重的地位。因證立法、隨法選方、據方施藥是中醫臨床診療的環節，缺一不可。雖然蘊含著豐富而寶貴的臨床經驗，但在中醫理論方面存在著主觀性、模糊性及不確定性等方面的不足。因此，需要利用現代技術建立客觀的評價標準，使中醫理論更加客觀、更加科學。色譜質譜聯用技術可以鑒定不同中醫證候的潛在生物標志物，識別中藥代謝通路，從而為中醫現代化研究提供有力工具。

2.1 色譜質譜聯用技術對T2DM不同中醫證候生物標志物的識別中醫以辨證論治為核心，準確化、規范化的辨證不僅是論治的前提，還是提高臨床療效的關鍵。“證”是疾病過程中某一階段或某一類型的病理概括，“證候”是病理狀態的宏觀表現，對中醫證候分類的客觀化研究有利于進一步認識中醫證的本質。代謝組學的整體性和動態性符合中醫的“整體觀”和“辨證法”的特征，近年來在中醫證候分類研究中也取得了不少成果。

楊宇峰等［31］采用超高效液相色譜四極桿飛行時間質譜技術對T2DM脾氣虛證大鼠模型的血清進行代謝組學研究，發現2-羥基丁酸、赤蘚糖、L-絲氨酸、苯丙氨酸、尿苷二磷酸、L-高絲氨酸等代謝產物水平顯著上調，這些物質與體內糖類、脂類、蛋白質等代謝紊亂息息相關。孫思怡采用LC-MS技術分析T2DM上熱下寒證患者的血漿，發現了37種有差異的代謝產物，主要涉及11個代謝途徑，認為乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿可作為T2DM上熱下寒證的特異性生物標志物。YANG等［32］對T2DM血瘀證大鼠模型的血漿進行超高效液相色譜四級桿飛行時間串聯質譜代謝組學研究，發現了46種有差異的代謝產物，主要與脂質代謝、半乳糖代謝、亞油酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、糖酵解和花生四烯酸代謝等代謝途徑相關。汪曉娟采用LC-MS技術對2型糖尿病腎病Ⅲ期氣陰兩虛證患者的血清進行代謝組學研究，鑒定出17種有差異的代謝產物，主要以脂代謝紊亂為主，其中磷脂酰甘油、鞘磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺可作為2型糖尿病腎病Ⅲ期氣陰兩虛證的潛在生物標志物。

中醫講究四診合參，通過“望、聞、問、切”收集患者臨床資料，從而進行辨證論治、遣方用藥。然而中醫證候分類在實際應用中主要依賴醫生的主觀判斷，缺乏客觀證據支持，而對中醫證候分類的不合理或不正確的判斷可能導致處方不正確，直接影響臨床治療。通過色譜質譜聯用技術可以識別出不同中醫證型的潛在生物標志物，這些生物標志物可以為中醫證候分類提供客觀化、科學化的參數指標，從而指導中醫臨證，提高臨床療效。

2.2 色譜質譜聯用技術對T2DM相關中藥代謝通路的識別色譜質譜聯用技術不僅為中醫證候分類的客觀化需求提供了理論上和技術上的可能，也為下一步通過中藥干預代謝機制研究奠定基礎。時正媛等［33］采用超高效液相色譜—串聯四極桿飛行時間質譜技術發現金芪降糖片（黃芪、黃連、金銀花組成的中藥復方制劑）可以使溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）（18∶0）和LysoPC（16∶1）等9種代謝物下調，LysoPC（18∶1）和LysoPC（20∶0）等6種代謝物上調，可能通過調節脂代謝紊亂而緩解T2DM的進程。周元等［34］發現，黃芩對T2DM大鼠糞便中的三羥基三甲基吲哚酮、白三烯、亮氨酰脯氨酸和雌二醇等含量具有調節作用，主要干預鞘脂類代謝和脂肪酸代謝。周子妍等［35］發現葛根芩連湯可以通過調節膽汁酸代謝、磷脂代謝以及腸道菌群代謝從而降低T2DM胰島素抵抗大鼠模型的胰島素抵抗指數，同時預防血糖升高。孫麗麗等［36］對給予當歸補血湯干預的T2DM小鼠模型的血清進行代謝組學研究，發現了16種潛在的生物標志物，涉及7個主要的代謝途徑，從而推測當歸補血湯可能通過提高機體對胰島素敏感性、調節糖脂代謝紊亂、減輕炎癥反應等緩解T2DM的進程。以上研究表明，運用色譜質譜聯用技術可識別藥物代謝通路、監測藥物作用途徑，使得藥物在人體的作用機制更加可視化、微觀化，這對于實現臨床精準用藥具有重要意義。

綜上所述，色譜質譜聯用技術在T2DM發生發展過程中已經識別了大量的潛在生物標志物，這使得對T2DM的生理病理機制認識更加系統化、微觀化。色譜質譜聯用技術識別不同中醫證候分類生物標志物，使得中醫辨證論治更加客觀化、科學化，從方法論的層面為中醫辨證論治的應用提供了理論依據。此外，色譜質譜聯用技術在中藥代謝通路識別中的應用，既為臨床精準用藥提供了可能，也為未來挖掘具有降糖作用的中藥或中成藥提供有力工具。但目前的研究仍存在一些不足：T2DM是一個動態發展的異常變化過程，目前的研究多從靜態角度切入研究，忽略疾病過程中代謝標志物的整體動態變化。未來若能著眼于動態角度的研究，對T2DM的生理病理機制將會有更加深入的認識；在T2DM及相關并發癥方面已取得一些研究成果，但對糖尿病前期的研究尚少，論據不足，未來可針對糖尿病前期開展相關性研究，“未病先防”也是臨床工作的重要著眼點；目前只針對個別中醫證型進行代謝組研究，若能深入開展中醫證候的系統生物學研究，完善中醫辨證論治體系的證候學基礎，不失為中醫現代化研究的新突破口。