miR-128、ZEB1對子宮內膜癌細胞遷移侵襲和上皮間質轉化的影響及其靶向關系驗證

李品，蔡智慧，李晶晶，王琰，陳靜，杜曉欣，王蘭，閆麗偉

1 河北大學附屬醫院婦科，河北 保定 071000；2 河北大學附屬醫院麻醉科

子宮內膜癌（EC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，約占女性癌癥的4.8%，并且發病率和病死率均有上升趨勢［1］。侵襲或轉移是EC惡性發展的主要原因之一，盡管早期階段的EC患者的5年生存率可高達82%，但對于復發或晚期EC患者，5年生存率仍低于30%［2］。對于晚期EC患者采用手術切除、化療和放療等傳統治療策略效果較差，并且化療和放療通常會對健康組織和器官造成有害影響［3］。因此，了解EC內在的分子機制對于尋找新的靶向治療方法、改善EC患者的治療效果和預后具有重要意義。

miRNA是一類小的非編碼RNA，在轉錄后水平調節基因表達，參與人類疾病發展的一系列生物學過程，尤其是腫瘤的發生發展［4］。miR-128是近年發現的miRNA家族成員之一，研究發現，其在人類多種惡性腫瘤中表達異常，與腫瘤細胞的侵襲轉移等惡性表型密切相關［5］。目前有關miR-128在EC中的研究甚少，并且其對EC細胞遷移和侵襲的影響尚不清楚。鋅指E盒結合同源框1（ZEB1）是近年來研究較多的與惡性腫瘤細胞侵襲轉移密切相關的轉錄調節因子［6］。研究［7］發現，ZEB1在EC中表達異常升高，并且沉默ZEB1能夠顯著降低EC細胞侵襲和轉移能力［8-9］。目前研究［10-11］發現，miR-128能夠調控ZEB1參與機體細胞重要的生命活動，但miR-128是否通過調控ZEB1影響EC細胞的侵襲轉移尚不清楚。2021年8月—2022年4月，本研究觀察了EC細胞系中miR-128和ZEB1的表達變化，并進一步探討了miR-128對Ishikawa細胞的遷移、侵襲及上皮間質轉化的影響以及其與ZEB1的靶向調控關系，探討miR-128與ZEB1在EC侵襲轉移中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、儀器人子宮內膜上皮細胞hEEC及人EC細胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE均購自中國科學院上海細胞庫，均置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37℃、5% CO2的培養箱中培養。待細胞融合度達80%時，應用0.25%胰酶消化進行傳代培養。RPMI-1640培養基、胎牛血清均購自美國Hyclone公司；miRNA抽取試劑、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和qRT-PCR熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；熒光素酶報告基因質粒ZEB1-WT和ZEB1-MUT、miR-128模擬物（miR-128 mimics）、miRNA陰性對照（miRNA-NC）及PCR引物均購自上海吉瑪制藥公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質膠購自美國BD公司；E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1及GAPDH抗體均購自美國Abcam公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；PCR儀、光學顯微鏡、電泳儀購自美國Bio-Rad公司；CO2細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；超凈工作臺購自上海力新儀器有限公司。

1.2 HEC-1A、Ishikawa、KLE及hEEC中miR-128的檢測采用qRT-PCR法。應用miRNA抽取試劑提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，以cDNA為模板，加入PCR引物，按照qRTPCR試劑盒說明書操作配制PCR反應體系進行PCR反應。PCR反應參數：95℃、2 min；95℃、15 s，60℃、15 s共40個循環。miR-128上游序列：5′-CGCCGATATTGGTCGGATGAT-3′，下游序列：5′-TTC AGCGTACACCTAATCGGTATG-3′；U6上游序列：5′-CCGTCGTAGGCAGCCTCTACGCT-3′，下游序列：5′-GCATCCAACGTACGCTCATCGT-3′。以U6作為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-128基因相對表達量。由于miR-128在Ishikawa細胞系中的表達水平最低，因此本研究選擇Ishikawa細胞系作為后續過表達miR-128轉染實驗的細胞系，這樣過表達miR-128效果更加明顯。

1.3 細胞分組及miR-128轉染將Ishikawa細胞分為miR-128過表達組和陰性對照組。轉染操作時，取對數增殖期的Ishikawa細胞，以1×105個/孔的細胞密度接種于6孔細胞板，按照Lipofectamine2000試劑盒說明書進行轉染操作，分別轉染miR-128 mimics和miRNA-NC至Ishikawa細胞，轉染后繼續置入37℃、5% CO2的恒溫環境中繼續培養，12 h后更換新鮮培養基，48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.4 Ishikawa細胞侵襲能力的觀察采用Transwell侵襲實驗。首先取出Mgtrigel膠與無血清培養基混合，均勻鋪于Transwell小室上室底膜上室面。取轉染后48 h各組Ishikawa細胞，無血清細胞培養基重懸，調整細胞密度至3×105個/mL。取200 μL細胞懸液接種至小室上室，下室注入500 μL含10%胎牛血清的細胞培養基，將小室于37℃、5% CO2的恒溫條件下，繼續培養48 h，輕輕拭去小室上室面未穿膜的細胞，多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色30 min，高倍光學顯微鏡隨機選擇5個不重復的視野計數拍照并計數穿膜的細胞數目。

1.5 Ishikawa細胞遷移能力的觀察采用細胞劃痕實驗和Transwell遷移實驗。①細胞劃痕實驗：收集轉染后48 h各組Ishikawa細胞，制備細胞密度1×106個/mL的細胞懸液，均勻接種于6孔細胞板各孔中，充分混勻，置入37℃、5% CO2的恒溫箱中培養，細胞融合度至100%時，應用20 μL移液槍頭垂直6孔板底部劃出一字劃痕，PBS沖洗后，加入無血清細胞培養基繼續培養，分別于0和48 h時刻用光學顯微鏡拍照，Image J軟件計算劃痕愈合率。②Transwell遷移實驗：Transwell遷移實驗時不對小室底膜上室面進行Mgtrigel膠預鋪，余實驗步驟同Transwell侵襲實驗。

1.6 Ishikawa細 胞 中E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1蛋白的檢測采用Western blotting法。收集各組細胞，應用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。每泳道取同等量總蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜上，洗膜后，將PVDF膜置于5 %的脫脂牛奶封2 h，洗滌后將PVDF膜置入一抗E-cadherin（1∶1 000）、Fibronectin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、ZEB1（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）溶液中4℃孵育過夜，次日置于二抗溶液中孵育1 h，ECL顯影，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.7 miR-128靶向結合ZEB1 3′UTR區的驗證采用雙熒光素酶報告基因實驗。取對數增殖期的Ishikawa細胞，接種于6孔細胞板中，應用Lipofectamine2000轉染試劑，分別將野生型ZEB1熒光素酶報告基因質粒ZEB1-WT、突變型ZEB1熒光素酶報告基因質粒ZEB1-MUT與miR-128 mimics或miRNA-NC共轉染至Ishikawa細胞，分別為miR-128 mimics+ZEB1-WT組、miRNA-NC+ZEB1-WT組、miR-128 mimics+ZEB1-MUT組、miRNA-NC+ZEB1-MUT組。轉染24 h后，收集細胞，應用熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 統計學方法采用SPSS21.0統計軟件。正態分布檢驗采用Shapiro-wilk法檢驗，符合正態分布的計量資料采用±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC細胞系及子宮內膜上皮細胞系hEEC中miR-128、ZEB1蛋白相對表達量比較EC細胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE及 子 宮 內 膜 上 皮 細 胞系hEEC中miR-128的相對表達量分別為0.43±0.12、0.28±0.09、0.48±0.11、1.02±0.04。與hEEC相比，HEC-1A、Ishikawa、KLE細胞中miR-128的相對表達量均降低（t=8.08、13.01、7.99，P均＜0.05）。Western blotting結果顯示，EC細胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE及 子 宮 內 膜 上 皮 細 胞系hEEC中ZEB1蛋白的相對表達量分別為0.91±0.14、1.14±0.18、1.06±0.19、0.21±0.11。與hEEC相比，HEC-1A、Ishikawa、KLE細胞中ZEB1蛋白的相對表達量均升高（t分別為6.81、7.64、6.71，P均＜0.05）。

2.2 過表達miR-128對Ishikawa細胞遷移、侵襲的影響qRT-PCR結果顯示，陰性對照組和miR-128過表達組Ishikawa中miR-128相對表達量分別為0.98±0.04、3.41±0.23。兩組比較，t=18.03，P＜0.05，提示轉染效率較高。細胞劃痕實驗結果，陰性對照組和miR-128過表達組Ishikawa細胞劃痕愈合率分別為（65.5±7.3）%、（25.2±4.1）%，兩組比較，t=8.34，P＜0.05。Transwell遷移實驗結果，陰性對照組和miR-128過表達組Ishikawa細胞遷移穿膜數量分別為（421±44）、（172±31）個，兩組比較，t=8.01，P＜0.05。Transwell侵襲實驗結果，陰性對照組和miR-128過表達組Ishikawa細胞侵襲穿膜數量分別為（414±49）、（229±40）個，兩組比較，t=5.07，P＜0.05。

2.3 過表達miR-128對Ishikawa細胞E-cadherin、Fibronectin、Vimentin、ZEB1蛋白表達的影響miR-128過表達組Ishikawa細胞中E-cadherin蛋白相對表達量高于陰性對照組（t=5.55，P＜0.05），Vimen-tin、Fibronectin、ZEB1蛋白相對表達量低于陰性對照 組（t分別為5.38、5.32、12.55，P＜0.05）。見表1。

表1 兩組細胞中上皮間質轉化相關蛋白及ZEB1的相對表達量比較（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

組別miR-128過表達組陰性對照組E-cadherin 1.12±0.16*0.46±0.13 Fibronectin 0.56±0.14*1.26±0.18 Vimentin 0.43±0.10*0.99±0.15 ZEB1 0.19±0.07*0.96±0.08

2.4 miR-128與ZEB1的靶向關系雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-128 mimics+ZEB1-WT組、miRNA-NC+ZEB1-WT組、miR-128 mimics+ZEB1-MUT組、miRNA-NC+ZEB1-MUT組Ishikawa細胞的相對熒光素酶活性分別為0.40±0.11、0.98±0.06、0.97±0.04、1.03±0.06。與miRNANC+ZEB1-WT組相比，miR-128 mimics+ZEB1-WT組Ishikawa細胞的相對熒光素酶活性明顯降低（t=8.02，P＜0.05）；而與miRNA-NC+ZEB1-MUT組相 比，miR-128 mimics+ZEB1-MUT組Ishikawa細胞的相對熒光素酶活性無明顯變化（t=1.44，P＞0.05）。

3 討論

EC是女性癌癥患者死亡的重要原因。近年來，EC的發病率和病死率一直居高不下，晚期EC患者通常有較高的復發率和不良預后，治療效果不能令人滿意［12-13］。至今EC發生發展的分子生物學機制尚不清楚，因此探索EC的發病機制，尋找新的診斷和治療EC的靶向基因具有重要意義。

近年研究［14］發現，miRNA可以通過對下游關鍵基因mRNA翻譯的抑制或者降低mRNA的穩定性從而影響下游分子通路的活性，起著重要的調控作用。將miRNA作為腫瘤分子治療的靶點，恢復細胞的正常分子表型，從而起到抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，是目前腫瘤研究的熱點問題。SHIGETA等［15］發現，miR-152低表達與EC患者的不良預后密切相關，過表達miR-152能夠抑制EC細胞的增殖及侵 襲 遷 移。miR-29a-3p［16］、miR-543［17］、miR-379-5p［18］等miRNA也被相繼證實作為EC的抑制因子發揮作用。目前EC細胞中已經發現了許多差異表達的miRNA，這表明它們可能在EC發生發展中起著重要的作用［19］。但至今尚未發現在EC發生發展中起著最關鍵作用的miRNA。miR-128是一種在腦神經系統高表達的miRNA，既往研究主要集中在其與神經系統疾病的關系，近期研究發現其與惡性腫瘤細胞的分子表型也密切相關［5］。在結直腸癌［19］、骨腫瘤［20］、口腔鱗癌［21］等惡性腫瘤中均發現miR-128作為抑癌因子發揮作用。本研究通過qRT-PCR發現EC細胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE中miR-128表達均明顯降低，提示miR-128在EC發生發展中可能也起著抑癌因子的作用。由于miR-128在Ishikawa細胞系中的表達水平最低，因此本研究選擇Ishikawa細胞系作為后續過表達miR-128轉染實驗的細胞系。進一步本研究通過脂質體轉染的方法，轉染miR-128模擬物至Ishikawa細胞過表達miR-128，細胞劃痕實驗和Transwell實驗顯示過表達miR-128的Ishikawa細胞劃痕愈合率、遷移和侵襲穿膜細胞數目均明顯下降，提示過表達miR-128能夠明顯抑制EC細胞的遷移及侵襲能力。上皮間質轉化是上皮細胞表型由上皮向間質轉換的生物學過程，腫瘤細胞通過上皮間質轉化獲得間質細胞特性，失去黏附能力和緊密連接從而獲得侵襲轉移能力，因此上皮間質轉化是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵步驟。本研究發現過表達miR-128的EC細胞中間質源性標志物Fibronectin、Vimentin蛋白的表達水平明顯降低，而上皮源性標志物E-cadherin蛋白表達顯著升高，提示過表達miR-128能夠明顯抑制EC細胞的上皮間質轉化。

ZEB1是ZEB同源盒轉錄因子家族的重要成員之一，其定位于人第10號染色體上，在胚胎發育中起著重要調節作用。近年研究［6］發現，ZEB1在惡性腫瘤細胞上皮間質轉化的過程中也發揮著調控作用，其表達異常與惡性腫瘤細胞的侵襲轉移能力有關。FENG等［22］在研究中發現，ZEB1在EC組織中表達升高，并且與腫瘤分級、肌層浸潤和淋巴結轉移顯著相關。XIAO等［8］研究證實，ZEB1能夠調控上皮間質轉化影響EC細胞的侵襲遷移能力。近期研究［10］發現miR-128能夠調控ZEB1參與食管癌細胞的侵襲轉移。miR-128還能夠靶向ZEB1調節前列腺癌細胞的化療敏感性和侵襲性［11］。本研究發現，過表達miR-128的EC細胞中ZEB1蛋白的表達水平明顯降低，并且雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示miR-128能夠與ZEB1的3′UTR區靶向結合。以上提示miR-128影響EC細胞的遷移、侵襲及上皮間質轉化等惡性表型，可能是通過靶向調控ZEB1實現的。

綜上所述，miR-128可以抑制Ishikawa細胞的遷移、侵襲及上皮間質轉化，ZEB1可促進Ishikawa細胞的遷移、侵襲及上皮間質轉化，miR-128與ZEB1具有靶向調控關系。但由于條件限制，本研究沒有對miR-128與ZEB1在EC組織中的表達及臨床病理特征關系進行研究，有待將來的實驗中在組織學層面對miR-128、ZEB1在EC發生進展中的作用進行深入探討。