慢性疲勞綜合征動物模型研究概況

李諾,楊添淞,馮楚文,屈媛媛,王慶勇,王德龍,李超然,楊燕,孫忠人，4

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院教務科，哈爾濱 150040； 3.浙江中醫藥大學附屬第三醫院針灸科，杭州 310005； 4.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院針灸科，哈爾濱 150001)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)又稱肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞綜合征，是一種嚴重、慢性、復雜的多系統異質性疾病[1-3]，目前應用最廣泛的CFS診斷標準為CDC-1994診斷標準。CFS的主要臨床表現為嚴重的中樞性疲勞及勞力后不適，并伴隨記憶力減退、抑郁、軀體疼痛等癥狀[4-5]。流行病學調查數據顯示，全球CFS患者占總人口的0.1%～1%[5-6]。據報道，25%～29%的CFS患者只能居家或臥床，且超過半數患者失業，只有19%的CFS患者全職工作，與癌癥、多發性硬化癥和腦卒中患者相比，CFS患者的生活質量更差[7-9]。CFS的發病機制十分復雜，涉及氧化硝化應激、免疫炎癥反應、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸活動減退、腦神經遞質失調、線粒體功能障礙、能量代謝障礙及遺傳易感性等[5,10-12]。動物模型是研究CFS的有力工具，但由于CFS的異質性及多重發病機制，目前國內外尚無全面模擬人類CFS臨床表現和發病機制的動物模型。現就國內外常用CFS動物模型的造模原理和建立方案予以綜述，以期為CFS模型的研究提供參考。

1 單因素造模

1.1強制游泳法(forced swimming test，FST) 目前，國外最常用的CFS實驗模型造模方法為FST，該造模方法模擬人類遭受的軀體和精神應激，將動物長期暴露于不可逃脫的環境中，使實驗動物表現出身心疲勞、焦慮、抑郁等行為學改變，刺激導致氧化應激增加、線粒體功能障礙、HPA軸功能減退、促炎性細胞因子水平及腦內神經遞質水平發生改變。

Thakur等[13]將雄性白化小鼠置于室溫(22±3) ℃水容器內游泳至力竭，每日10 min，連續21 d后，雄性白化小鼠出現CFS樣癥狀，表現為疲勞和焦慮樣行為，并伴有氧化應激增加、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅱ減少以及腦內神經遞質多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平下降。上述CFS模型小鼠的臨床、病理表現與人類CFS相似，可用于氧化應激、線粒體功能障礙等方面的CFS研究，但CFS模型小鼠的5-HT水平下降，與研究報道的人類CFS患者5-HT水平升高相反[14]，這可能與檢測時間和部位不同有關，仍有待進一步研究。Surapaneni等[15]將Charles Foster白化大鼠置于室溫(24～28) ℃環境中游泳至力竭，每日15 min，連續21 d，大鼠出現疲勞、抑郁和焦慮樣行為，同時氧化應激增加，前額皮質線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性、線粒體膜電位及腎上腺重量和血漿皮質酮水平均下降，符合CFS線粒體損傷、氧化應激增強及HPA軸功能減退的病理機制。另有研究顯示，FST可引起雄性白化小鼠促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平升高，提示炎癥反應的發生[16]。

使用FST造模時，造模時間尤為關鍵。目前大多數采用FST建模的研究建模耗時在2周以上[13,15]。造模時需確保整個實驗過程中水深足夠且恒定，以防止實驗鼠逃脫或鼠尾接觸容器底部，且每次使用均重新更換用水。此法操作性強、重復性及穩定性好，可模擬CFS的疲勞、焦慮、抑郁等臨床特征，符合CFS線粒體功能障礙、氧化應激增加及HPA軸功能減退的發病機制。但FST對CFS特征癥狀勞力后不適的影響尚不清楚。另外，FST力竭游泳時間的界定尚不統一，相關文獻多將鼠頭沒于水面10 s作為力竭標準[17]，由于操作過程中環境干擾因素較多，無法準確測量FST的不動時間。

另有學者利用負重力竭游泳法建立身心疲勞的CFS模型，通過氧化應激介導CFS[18]。Sachdeva等[19]將負重其自身體重(10±2)%的雄性Wistar大鼠置于(22±3) ℃水中游泳至力竭，連續28 d后發現，大鼠出現疲勞、痛覺過敏、記憶障礙，并伴有氧化硝化應激和血清TNF-α水平升高，提示氧化硝化應激、促炎性細胞因子參與CFS的負荷模型。Zhang等[20]報道，負重力竭游泳法不僅可模擬類似疲勞的CFS癥狀，還可導致前額皮質中成熟白細胞介素(interleukin,IL)-1β和血清丙二醛水平顯著升高，并伴有前額皮質中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體表達增加，而核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體形成以及成熟IL-1β產生增加均符合人類CFS病理機制。采用負重力竭游泳法建立的CFS動物模型的表現和發病機制與人類CFS接近，但其在模擬臨床癥狀(如勞力后不適)及病理機制(如線粒體功能障礙)等方面有一定的局限性，且動物負重物體不統一，易在實驗過程中滑脫。

1.2免疫誘導法 感染是觸發CFS的致病因素之一，可誘發免疫功能紊亂和中樞神經系統損傷[21-23]，最終發展為CFS。目前常被用于構建CFS模型的病原體有純化的脂多糖、流產布魯氏菌和聚肌胞苷酸。

1.2.1細菌誘導法 細菌誘導法造模的機制是利用脂多糖或流產布魯氏菌等抗原與細胞系統相互作用，刺激活性氧產生、過氧亞硝酸鹽形成以及促炎性細胞因子釋放，導致動物機體發生氧化硝化應激、免疫紊亂和中樞神經系統損傷，進而誘發CFS[24-28]。Gupta等[28]予白化Laca小鼠腹腔注射脂多糖(1 mg/kg，每日1次)，連續19 d后小鼠不動時間、痛覺過敏增加，且氧化應激增加、TNF-α水平升高，成功建立CFS模型。Lee等[29]予雄性ICR小鼠單次腹腔注射脂多糖(3 mg/kg)后發現，其運動活動、肌肉力量或疼痛敏感性均未受影響，且被動回避實驗中無記憶喪失，前額皮質和海馬中5-HT1A受體顯著激活，以上情況均與人類CFS相反[14]。此外,模型小鼠血清皮質酮水平升高，而多數研究表明，CFS患者皮質酮水平下降，這可能與應激誘導的HPA軸功能亢進在長時間應激后轉換為HPA軸功能減退有關[30-31]。因此，該模型不適合CFS動物模型。

持續19 d腹腔注射流產布魯氏菌(0.2 ml/只)Laca小鼠的不動時間、痛覺過敏、氧化應激增加，且TNF-α水平明顯升高[28]，提示小鼠發生氧化應激及免疫激活。Chen等[32]給予雌性BALB/c小鼠尾靜脈注射流產布魯氏菌(0.2 ml/只)6次后，小鼠出現日常活動減少、腦重/體重降低，并伴有海馬中B細胞淋巴瘤/白血病-2和腦源性神經營養因子表達水平降低。此模型制作簡單、重復性好，模型癥狀和病理改變與人類CFS相似，但模型動物死亡率較高，且缺少對海馬重量的觀察。另外，此模型在模擬臨床特征(如睡眠障礙和認知異常)方面有一定的局限性。

1.2.2病毒誘導法 病毒誘導法是使用聚肌胞苷酸感染的雙鏈RNA進行造模。Lee等[29]予雄性ICR小鼠單次腹腔注射聚肌胞苷酸(20 mg/kg)后，小鼠出現明顯的抑郁樣行為，且5-HT轉運體和5-HT1A受體明顯激活，腦內5-HT和色氨酸羥化酶2水平降低，這與人類CFS的發生機制不符。此外，CFS模型小鼠血清皮質酮水平升高，而CFS患者皮質酮水平下降[30-31]。因此，聚肌胞苷酸注射誘導不適用于CFS動物模型的建立。

1.3慢性束縛應激法 慢性心理應激能夠直接單獨誘發CFS癥候群[33-34]。慢性束縛應激是最常用的心理應激源，屬于非損傷刺激。慢性束縛應激用于CFS模型制作的原理是模擬發達地區狹小生活環境空間對人類心理的影響，使模型動物再現人類CFS的疲勞、記憶力下降、抑郁等癥狀。王天芳等[34]將雄性Wistar大鼠放入特制束縛筒內，以大鼠無強烈反抗為度，每天3 h，造模時間段隨機，連續14 d，使大鼠出現記憶力下降、抑郁傾向及活動減少、運動能力下降等疲勞癥狀。孟昭琴等[35]在改進慢性束縛應激模型中發現，連續4周慢性束縛應激循序加量1次，刺激時間分別為2、2.5、3、3.5 h，每日1次，每周5 d，模型動物更易出現CFS癥狀，同時無特定病原體級雄性Wister大鼠體重、血清睪酮水平、胸腺重量顯著降低，IL-4水平下降、皮質酮水平升高，與人類CFS中IL-4水平升高、皮質酮水平降低相悖；且該模型大鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)水平明顯降低，與CFS早期階段的患者IFN-γ水平升高相反[30-31,36-37]。慢性束縛應激可操作性強、重復性好，與人類CFS相似程度高，可用于研究CFS的炎癥反應和神經內分泌系統紊亂，但其模擬氧化應激增加、線粒體功能障礙等CFS病理機制的能力有限。此外，慢性束縛應激還存在建模方案各異、造模工具不統一的問題。

2 多因素復合CFS模型

2.1慢性束縛應激+強制冷水游泳法 人類CFS的發病機制復雜，故目前多采用復合因素刺激建立CFS模型，以使其具有與人類CFS更好的關聯性，其中慢性束縛應激+強制冷水游泳法造模最具代表性，也是目前國內最常用的CFS造模方法，其造模原理是將慢性束縛模型與強制冷水游泳模型結合，使心理和軀體應激共存，可達到與人類CFS較為接近的身心疲勞癥狀，且符合氧化應激增加、神經內分泌和免疫系統功能紊亂的病理機制，但該方法操作步驟和類型多樣，目前尚無統一標準。He等[38]給予無特定病原體級雄性Wistar大鼠冷水游泳刺激，每日8:00將大鼠置于水溫(15±2) ℃的容器內進行力竭游泳，并于每日15:00進行慢性束縛應激造模，每日1次，每次1 h，連續21 d后發現，模型大鼠出現疲勞樣改變，并伴有血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、IFN-β、IFN-γ、乙酰膽堿酯酶水平、CD3+、CD8+T淋巴細胞百分比以及總抗氧化能力的明顯降低，而IFN-α水平、丙二醛活性及CD4+T淋巴細胞百分比均顯著升高，此模型的癥狀和病理機制與人類CFS接近，但血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白M以及IFN-γ水平下降，與人類CFS不符[37,39]。錢桂鳳等[40]發現，除食欲不振、精神萎靡及活動減少外，雄性SD大鼠還伴有氧化應激標志物丙二醛水平升高以及抗氧化劑超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性降低。成詞松等[41]研究顯示，雌雄兼用SD大鼠體內促腎上腺皮質激素釋放激素、血漿促腎上腺皮質激素及皮質酮水平降低，提示存在HPA軸功能減退。王向義等[42]采用慢性束縛應激+強制冷水游泳法造模，結果顯示，雄性SD大鼠體重下降，血清IFN-γ水平降低，IFN-γ/IL-4比值下降，提示輔助性T細胞2處于優勢狀態。

2.2束縛+擁擠+噪音+跑臺法 束縛+擁擠+噪音+跑臺法模擬現代人生存環境(活動時間范圍受限、生活空間擁擠、環境嘈雜、軀體處于疲勞狀態)所導致CFS的發病途徑，使模型動物再現人類CFS的焦躁、抑郁、疲勞等癥狀。Chi等[43]采用束縛、跑臺、擁擠、噪音的方法建立CFS模型，束縛：將雌性SD大鼠置于內徑5.0 cm、長度20 cm的PVC管中，每次4 h；跑臺：強迫大鼠進行跑臺運動(20 m/min，每日1 h)；擁擠：每組10只大鼠生活在一個標準飼養籠中；噪音：播放搖滾樂刺激大鼠，每日4 h，應用以上方式連續造模28 d后，大鼠出現焦慮、記憶力下降、身心疲勞癥狀。Shao等[44]基于以上分析結果，將SD大鼠跑臺運動速度增加至25 m/min，暴露于搖滾樂的時間增加到12 h，結果表明與疲勞相關的血液生化指標血尿素氮水平升高，皮質酮水平下降，符合人體CFS的病理機制，運用氣相色譜-質譜分析表明，SD大鼠尿液中三羧酸循環、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、鞘脂代謝和類固醇激素生物合成均有一定紊亂。束縛+擁擠+噪音+跑臺法建立的CFS模型的癥狀與人類CFS吻合度較高，但其與人類氧化應激、免疫炎癥反應、線粒體功能障礙及腦內單胺類神經遞質改變等發生發展機制的相似性仍需深入研究。

2.3負重力竭游泳+慢性不可預知應激法 已知CFS的發生發展是一個多因素的過程，負重力竭游泳+慢性不可預知應激法應用多因素聯合刺激建立CFS模型，模擬現代人體力超負荷運轉、本能受挫、處于嘈雜環境等致病因素，以最大限度地復制人類各方面不定期的負性因素，進而誘導多重應激疲勞癥狀。楊燕等[45]將負重自身體重5%鉛塊的無特定病原體級雄性SD大鼠置于(25±2) ℃水中游泳至力竭，每日1次，并于每次負重力竭游泳后隨機進行以下任意兩種不可預知的應激刺激：禁食12 h、禁水 12 h、夾尾1 min、通宵照明、110分貝噪聲刺激1 h，采用以上方式連續刺激28 d后，大鼠出現記憶力下降、血清TNF-α和IL-10水平明顯升高、IFN-γ水平顯著下降，通過上述方法可建立炎癥反應相關模型，但制備過程煩瑣、實驗周期長，且IFN-γ水平變化與CFS患者不一致，故該模型與人類CFS氧化應激增加、線粒體功能障礙、腦內單胺類神經遞質改變及HPA軸活性降低等發生發展機制的相似性仍需深入研究。

3 小 結

目前，各類CFS動物模型均存在一定的缺陷。首先，尚無能夠完全模擬人類CFS多重發病機制公認、統一的CFS模型制備方案，且不同造模方法建立的動物模型的病理發展過程不同。其次，CFS的診斷標準尚不明確，現有CFS模型無法模擬CFS的所有臨床特征。在中醫藥研究中，目前CFS病證結合動物模型尚不足，且尚未形成科學的評價體系。未來，需要運用多組學技術結合多學科交叉合作及不同檢測指標聯合制備重復性更高、與人類CFS臨床表現和發病機制更接近的公認、合理的CFS動物模型，以期推動基礎科學研究向臨床實際應用的成果轉化。