葡萄球菌生物膜形成機制及中藥單體干預作用的研究進展

王小奇，寧毅，盧芳國

(湖南中醫藥大學醫學院，長沙 410208)

葡萄球菌(Staphylococcus)是革蘭陽性菌，是最常見的化膿性球菌，也是醫院交叉感染的重要來源[1-2]。生物膜也稱生物被膜，是能夠附著在物體表面并被細菌胞外大分子包裹的有組織的微生物群落[3-4]。葡萄球菌生物膜內微生物產生的胞外聚合物主要由多糖、脂質和核酸、蛋白質形成，具有高度水合極性，可保護葡萄球菌免受藥物的殺傷、破壞吞噬細胞、激活補體系統，以逃避宿主免疫系統的攻擊，降低宿主免疫力、防止其他細菌入侵等[5-8]。多數感染性疾病尤其是持續性感染亦與葡萄球菌生物膜的形成有關，如心內膜炎、囊性纖維化肺內持續感染、人工關節置換術后感染、膿毒血癥等[9-10]。由生物膜引起的持續性感染和多重耐藥性已成為臨床研究中備受國內外學者關注的公共衛生問題。

中藥單體是一種通過多途徑抑制葡萄球菌生長的多靶點天然活性藥物，可抑制群體感應系統下調相關基因的表達，使其生物膜形成受限，也可通過水解葡萄球菌聚集與釋放的關鍵蛋白以及破壞生物膜內部三維結構，使其無法形成完整的生物膜結構。現已發現中藥單體小檗堿能夠有效抑制葡萄球菌生物膜的生長[11-12]。現就葡萄球菌生物膜形成機制以及中藥單體干預生物膜形成的相關研究予以綜述，以期為抑制葡萄球菌生物膜形成的中醫藥研究提供新思路與新方法。

1 葡萄球菌生物膜形成過程及調控機制

葡萄球菌生物膜的形成是一個循環往復的動態過程，生物膜的生長周期分為初始黏附、定殖、成熟、擴散與分散4個階段。葡萄球菌生物膜形成的初始階段，菌體附著于物體表面發生可逆性附著。當葡萄球菌定植于物體表面后，葡萄球菌分泌胞外多糖并開始形成生物膜，葡萄球菌生物膜進入生長繁殖期，此時形成包含營養、通道、輸送系統的三維結構，成熟的生物膜通過蔓延、向外擴展，細菌由內部脫落、重新定植于物體表面等過程再次形成新的生物膜[13-14]。葡萄球菌生物膜最外層形成的天然屏障能夠抵御抗生素與藥物的侵襲。生物膜內的細菌表現出極強的耐藥性，其耐藥性是浮游細菌的10～1 000倍[15-16]。葡萄球菌生物膜的形成并不是單一因素調控，而是多種因素相互作用的結果，研究葡萄球菌生物膜的形成機制有助于篩選抗葡萄球菌感染藥物、提高藥物利用率，對有效遏制葡萄球菌生物膜生成具有重要意義。在葡萄球菌生物膜形成過程中，具有重要調控作用的群體感應系統、全局性調控因子、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)等是目前的關注熱點。

1.1群體感應系統 群體感應系統是細菌通過特定的信號分子濃度來感知周圍環境中自身及其他菌群的數量，當菌體外的信號分子分布達到一定閾值時，菌體內的調控機制激活基因的表達與轉錄被激活，進而調控菌體密度適應環境的變化。群體感應系統作為一種細胞間的信號轉導系統，對細菌生物膜的形成與分散具有重要意義[17-18]，群體感應系統能夠調節生物膜形成后所產生的三維立體結構中的營養物質、代謝產物及廢物的運輸，主要通過調控細菌的群體行為，對外界環境的變化迅速做出反應，從而提高細菌應對惡劣生態環境的生存率。因此，群體感應系統在細菌生物膜形成過程中發揮重要的調控作用，不同種屬的細菌通過激活不同的群體感應系統引發細菌聚集，進而誘導生物膜形成，其中葡萄球菌生物膜的形成由附屬基因調節子(accessory gene regulator，Agr)的細胞內群體感應系統調控。Agr系統包括PⅡ和PⅢ兩個啟動子，其中PⅡ編碼的蛋白構成了葡萄球菌的群感效應通路[19-21]。PⅡ有4個開放閱讀框，分別編碼AgrD、AgrB、AgrC和AgrA 4種蛋白。AgrD與AgrB負責信號分子自誘導肽(autoinducing peptide，AIP)的產生與加工[22-23]。成熟AIP分泌到細胞外，當胞外AIP濃度達到一定閾值時，AIP與受體組氨酸蛋白激酶AgrC結合，AgrC自動磷酸化后將磷酸基團傳遞給反應調控子AgrA，使其發生磷酸化修飾并被激活，激活后的AgrA與啟動子PⅡ和PⅢ基因間區域結合并啟動PⅡ和PⅢ基因的表達，PⅡ的表達能放大該通路中的信號轉導，大量AIP產生使葡萄球菌發生聚集，從而介導生物膜的形成。Agr系統與葡萄球菌生物膜的形成和相關毒力因子的產生密切相關[24-25]，因此篩選安全、高效的群感效應抑制劑是干擾并阻斷葡萄球菌生物膜形成的重要措施。抑制細菌群體感應的途徑主要有：①降解胞外或細胞膜上的信號分子；②干擾受體蛋白與信號分子結合；③抑制胞內信號分子合成。中藥含有多種天然的群體感應抑制劑，具有安全無毒、微量高效等作用特點，可通過高通量技術篩選其中的有效單體成分，進而深入挖掘其具體作用靶點，以揭示中藥單體抑制生物膜形成與群體感應系統的相關性，為開發中醫藥類型的群體感應抑制劑奠定基礎。

1.2全局性調控因子 全局性調控因子與葡萄球菌生物膜的形成密切相關，主要包括葡萄球菌輔助調節子A(staphylococcal accessory regulator A，SarA)及轉錄因子SigB(sigma B)。SarA受P1、P2、P3三個啟動子調控[26]，可控制上百個葡萄球菌基因的表達，是公認的金黃色葡萄球菌的主要毒力基因表達調控系統，能夠合成生物膜形成的初始階段所需的連接蛋白，并促進或抑制相關毒素的生成[27]。SarA表達增強能顯著促進葡萄球菌生物膜的生成，而SarA表達減弱則抑制葡萄球菌生物膜的生成。有研究證明，SarA突變葡萄球菌的生物膜生成量下降，其機制可能是SarA同時控制數個基因的轉錄，從而多靶點調控生物膜生成[28-29]，并不是僅依賴單一機制影響葡萄球菌生物膜的生成。SarA是細胞間黏附素(intercellular adhesion，ica)依賴型與非ica依賴型生物膜形成機制中的主要調節系統，SarA突變使ica表達降低，從而抑制生物膜的生成。同時，SarA能夠正向調控生物膜相關蛋白的生成，從而促進生物膜形成[30]。SigB是細菌應對外界干擾時產生應激反應的主要調控因子，也是葡萄球菌毒力基因表達調控的主要因子之一。SigB作用于金黃色葡萄球菌生物膜形成的初始黏附階段，能夠上調毒素基因的轉錄及纖維蛋白的表達[31]，并與非ica依賴型調控系統密切相關[32]，可促進葡萄球菌生物膜生成；其次，SigB能夠下調Agr系統中RNAⅢ的表達并降低胞外蛋白酶的活性，從而促進生物膜的生成[33]。

1.3ECM ECM是葡萄球菌生物膜的重要組成部分，主要成分包括胞外多糖、脂質、環境DNA(environmental DNA,eDNA)和表面蛋白等，其中以胞外多糖和蛋白質居多[34-35]。葡萄球菌定殖于物體表面后分泌大量ECM，ECM的數量隨生物膜的形成與成熟而不斷增加，對生物膜的形成發展及其結構的維持起到重要作用。ECM是保護葡萄球菌免受外界干擾的物理屏障，能夠阻斷外界抗生素以及有毒有害物質的入侵，提高生物膜內細菌在復雜環境中的抗逆性。icaADBC操縱子轉錄編碼產生的多糖ica是金黃色葡萄球菌產生的胞外多糖[36-38]，它可以介導細胞間黏附，在生物膜形成的第一階段起重要作用。臨床菌株分離與鑒定發現ica基因陽性菌株的耐藥性顯著高于其陰性菌株,表明多糖ica在生物膜形成中的重要性。此外，eDNA也在葡萄球菌生物膜形成中起重要作用，其通過細菌主動分泌、細胞溶菌等方式釋放到胞外，吸附在細菌表面并向外延伸，從而促使生物膜形成。eDNA不僅可介導黏附作用，還可與蛋白質交聯形成類似纖維網的結構，在維持生物膜三維結構穩定性中發揮重要作用。抑制ECM的形成或功能被認為是抑制生物膜生成的有效方法之一。有研究表明，DNaseⅠ能夠通過降解eDNA、分散素B降解胞外聚合物中互相粘連的一些多糖和蛋白質[39-40]，使完整的生物膜裂解，從而破壞生物膜的三維結構，逆轉細菌的耐藥性。

2 中藥單體抑制生物膜形成

中藥單體已成為繼傳統抗生素后治療持續性感染等的又一研究重點。中藥單體具有提取方式簡單、提純率高、進入菌體內作用途徑多樣化、作用靶點多、藥理效應調節機制廣等優點，在防治葡萄球菌生物膜引起的持續性感染疾病等方面具有獨特優勢。中藥單體不僅可抑制葡萄球菌生物膜的形成，其與抗生素聯用還可顯著提高抗生素的利用效率，從而減少耐藥性的產生。

2.1中藥單體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Stphylococcus aureus，MRSA)生物膜的影響 MRSA被稱為“超級細菌”，是臨床常見的耐藥菌株，也是院內感染和社區感染的重要病原菌之一，其感染人體的皮膚及軟組織后可導致社區性肺炎、嚴重敗血癥、感染性心內膜炎等。隨著β-內酰胺酶類和碳青霉烯類等臨床抗菌藥物的廣泛應用，MRSA耐藥性明顯增加，多重耐藥和泛耐藥菌株不斷出現，危害日益嚴重。而生物膜的形成進一步加重了MRSA的耐藥，給臨床治療帶來極大困難，因此，開發中草藥類的生物膜抑制劑對治療MRSA導致的持續性感染具有重要意義[41-43]。李玲等[44]研究發現，小檗堿可抑制MRSA生長與生物膜形成，且0.2 mg/ml的小檗堿能夠完全抑制MRSA的生物膜形成。覃靜等[45]研究發現，8 μg/ml的大黃酸能夠有效抑制生物膜內MRSA的生長，且大黃酸干預可使MRSA形態發生顯著變化，并顯著影響細胞通透性。由此可知，微量的大黃素可顯著抑制MRSA生物膜形成，是潛在的MRSA生物膜形成的抑制藥物。傅若秋等[46]研究發現，50 μg/ml花旗松素的抑菌率可達100%，且沒食子酸、二氫楊梅素也有明顯的抑菌作用，但該實驗僅聚焦于中藥單體的抑菌作用，其相關抑菌機制有待進一步研究。蘆薈在人體內的生物利用率較高，是潛在的抑制MRSA生長的中藥單體之一。周柳如和彭青[47]研究發現，蘆薈大黃素對MRSA的抑制效果最強，最低抑菌濃度值為2～8 μg/ml，微量使用也可產生抑菌作用。Ning等[48]通過構建高特異性氧化石墨烯納米生物傳感器檢測小檗堿作用后AgrA基因的表達，研究小檗堿干預后MRSA生物膜的形成機制，結果顯示，隨著小檗堿濃度的不斷增加，AgrA基因的表達量不斷下降，且生物膜的形成也不斷減少，表明小檗堿通過抑制AgrA基因表達減少AIP的形成，從而抑制生物膜的形成。畢月等[49]發現，大黃素濃度為8 μg/ml時的MRSA菌體抑制作用顯著，其機制可能是大黃素能夠干擾MRSA的DNA轉錄及復制，從而抑制其蛋白質合成。張璐璐等[50]發現，穿心蓮內酯與頭孢西丁聯用可明顯抑制MRSA生長，而單用頭孢西丁效果不顯著，但與穿心蓮內酯聯用時作用效果明顯增強，可能是穿心蓮內酯破壞了MRSA生物膜，使頭孢西丁利用率提高，起到良好的殺菌作用。

綜上所述，清熱、瀉下中藥中提取的單體能有效抑制MRSA菌體的生長。現已證明，小檗堿能夠通過抑制Agr系統中相關基因的轉錄表達，干預MRSA生物膜的形成[48,51]。此外，中藥單體與抗生素聯用也能對MRSA生物膜形成產生明顯的抑制作用，其機制可能是中藥單體通過破壞生物膜所形成的三維結構，提高傳統抗生素的滲透性，使其直接進入菌體并殺滅細菌，但中藥單體對MRSA生物膜形成的調節機制及其具體藥物聯用機制還需深入研究。

2.2中藥單體對金黃色葡萄球菌生物膜的影響 金黃色葡萄球菌是醫院和社區獲得性感染的最常見病原菌，可形成生物膜定植于導尿管、心臟瓣膜等植入性材料表面，是造成持續性感染的主要病原菌之一[52]。金黃色葡萄球菌形成的生物膜具有高度耐藥性，并對免疫系統的殺傷作用有較強的抵抗力，導致慢性化感染而難以清除控制。目前，抗生素仍是抑制生物膜形成的重要藥物，由于抗生素的不合理使用，金黃色葡萄球菌對抗生素的敏感性不斷下降，并逐漸由單類耐藥發展為多重耐藥，且發生低耐藥率到高耐藥率的演變。由生物膜介導的多重耐藥株的出現導致抗生素應用種類與應用劑量不斷增加，這不僅加大了抗菌藥物與細菌之間的自然選擇，更進一步促進了細菌耐藥性的產生。因此，開發新型、高效的中藥單體類型的金黃色葡萄球菌生物膜抑制劑對逆轉由生物膜產生的多重耐藥具有重要意義。

尉景娟等[53]研究發現，中藥單體丹參素及丹參酮ⅡA對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，并發現重樓皂苷、大黃蒽醌、黃芩黃酮、敗醬草皂苷等單體對金黃色葡萄球菌生物膜有一定的抑制作用。Chen等[54]研究發現，與萬古霉素相比，萬古霉素聯合中藥單體黃芩素破壞金黃色葡萄球菌生物膜形成的作用更強，同時發現32 μg/ml與64 μg/ml的黃芩素能夠下調群體感應系統中AgrA、RNAⅢ、SarA、ica基因的表達，從而破壞生物膜的形成，改變金黃色葡萄球菌生物膜的通透性，提高萬古霉素的利用率，達到抑制細菌生長的目的。Mirzahosseinipour等[55]構建的二氧化硅納米顆粒包被姜黃素的抗菌光動力系統在可見光激發、氧氣存在時，可促使金黃色葡萄球菌產生氧自由基，抑制生物膜的形成。姜黃素-二氧化硅納米系統對人正常成纖維細胞沒有顯著的細胞毒性作用，且具有促進創傷愈合的特性。Ma等[56]發現，裝載姜黃素的殼聚糖納米顆粒能夠顯著降低附著在物體表面的生物膜厚度，從而有效殺滅生物膜內包裹的金黃色葡萄球菌，在400 μg/ml濃度時，其對金黃色葡萄球菌的抑制率可達88.48%。Huang等[57]研制的以小檗堿和肉桂酸為原件的自組裝納米系統具有優良的抗菌活性，該納米復合物對菌體的強吸附性和高滲透性，使其對MRSA較傳統一線抗生素具有更好的抑制作用，且生物膜去除能力更強。中藥單體可有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，但因其溶解性低，利用率不高。通過提高中藥單體利用率增強中藥單體的整體殺菌作用是現階段的研究熱點，已有研究發現，利用納米材料與中藥單體結合的靶向遞藥系統對抑制細菌生長等有顯著作用，納米材料與中藥單體的結合能夠提高中藥單體的利用率，其與光熱療法結合后的殺菌作用明顯提高。有文獻報道，磁性氧化石墨烯結合光熱療法對分散態與聚集態MRSA的殺滅率分別達78%和97%[58]。但降低納米材料毒性的方法以及遞藥系統的具體效應與機制仍需深入研究。

2.3中藥單體對表皮葡萄球菌生物膜的影響 表皮葡萄球菌是滋生于生物體表的一類條件致病菌。近年來，由表皮葡萄球菌造成的醫院感染日益加重，而表皮葡萄球菌在人工關節、留置靜脈導管等醫用生物材料表面形成的生物膜可有效抵御抗生素的治療，導致感染遷延不愈，成為近年的研究熱點。隨著抗生素敏感性的逐年下降，越來越多的中藥單體用于抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，并發揮了獨特優勢。

官妍等[59]研究發現，連翹苷能夠顯著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，并降低表皮葡萄球菌的代謝活性，但其對生物膜形成初始階段的抑制效果并不顯著；同時，黃芩苷能抑制表皮葡萄球菌的生長。另有研究認為，苦參堿、魚腥草素鈉與紅霉素聯用能夠增加細胞膜的滲透性，提高藥物利用率，進而抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成[60]。王李俊等[61]發現，5.0 mg/ml的苦參總堿能夠顯著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，其作用機制可能與苦參總堿(主要成分包含苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿等)下調 serp2195和gpxA-2的表達有關，苦參總堿可能通過抑制上述基因的轉錄表達，抑制表皮葡萄球菌生物膜的生成。易輝等[62]研究發現，隱丹參酮能夠抑制表皮葡萄球菌ECM的形成并降低表皮葡萄球菌的代謝活性，進而抑制生物膜形成。但在生物膜逐漸成熟的過程中，低濃度的隱丹參酮不能起到抑制作用，表明隨著表皮葡萄球菌生物膜的逐漸成熟，需使用高濃度藥物才能有效抑制表皮葡萄球菌的生長，從側面說明表皮葡萄球菌生物膜形成后的耐藥性與抵抗藥物的侵襲作用越來越強，由此可見，最佳的抑制生物膜形成的階段可能是初始黏附階段。金桂林等[63]研究發現，大蒜素與環丙沙星聯用能夠降低icaA基因的表達，從而抑制表皮葡萄球菌生物被膜的生長，這為臨床用藥提供了新的思路與方法，能夠降低抗生素的使用量，減少耐藥菌株的產生。雍江堰等[64]研究二氫丹參酮Ⅰ聯合氨芐西林對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響，發現2 μg/ml二氫丹參酮Ⅰ與2 μg/ml氨芐西林聯合應用能夠有效抑制表皮葡萄球菌生物膜形成早期ECM的形成。姜大娥等[65]研究發現，土槿乙酸能夠抑制表皮葡萄球菌生物膜的生長，但并不能直接殺滅細菌，其具體機制還需進一步研究。綜上，上述多種中藥單體聯合抗生素抑制表皮葡萄球菌生物膜生長的研究僅為效應研究，其相關協同機制還需進一步探索。

3 小結與展望

目前，對葡萄球菌生物膜形成機制的探索取得了較大進展，但由于葡萄球菌生物膜耐藥機制復雜，還需進一步對生物膜的相關性質特點、代謝及營養運輸機制、聚合再定植機制、調控機制及其與人體免疫應激反應之間的關系等進行深入探索，這將為尋求藥物作用靶點、控制微生物多重耐藥提供理論指導。中藥單體可通過抑制群體感應系統及SarA的表達、降解ECM來抑制葡萄球菌生物膜的形成。與單獨使用抗生素相比，抗生素聯合中藥單體的抑菌效果更顯著，但部分中藥單體在抑菌作用中的利用效率非常低，且目前有關中藥單體干預生物膜的研究大多為體外實驗，尚不能模擬真實的體內抑制作用過程。因此，通過建立動物體內中藥單體抑制生物膜生長模型對其作用的藥效機制進行研究，尤其是干預胞內信號轉導及相關調控機制將成為中藥單體干預生物膜形成的研究重點。此外，利用納米材料和中藥單體進行自組裝構建的精準靶向遞藥系統不僅可有效提高藥物利用率、減少對人體的不良反應，還能在很大程度上防止耐藥性的產生。未來，隨著生命科學、化學生物學、材料學等交叉學科的發展，由生物膜導致的多重耐藥問題終將得到解決。