退變髓核細胞修復及組織工程應用研究進展

陳中，鄭陽，張信成，仇湘中，許輝

(1.湖南中醫藥大學研究生院，長沙 410208； 2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院骨傷科，長沙 410006)

腰腿痛是由椎間盤退變(intervertebral disc dege-neration，IDD)髓核突出壓迫或刺激周圍神經引起的一種常見癥狀。隨著我國人口老齡化的加快，IDD的發病率也逐漸升高，腰腿痛已嚴重影響人們的生活質量，造成致殘率升高和醫療成本增加[1]。髓核細胞來源于脊索細胞，在正常椎間盤與退變椎間盤內，水、纖維膠原蛋白和蛋白聚糖水平因個體和年齡等因素而存在差異，髓核內蛋白聚糖和水的含量最高，纖維膠原蛋白含量最低[2]。髓核細胞不可再生且具有重要功能，因此預防甚至逆轉髓核細胞退變顯得尤為重要。目前，針對IDD臨床主要通過外科手術減壓緩解臨床癥狀，雖然手術治療可取得良好療效，但會給患者帶來更大的身體創傷和經濟負擔，且手術治療無法逆轉退變椎間盤的病理狀態，使其喪失自我修復機會，同時手術干預還會破壞椎體正常生物力學結構，導致鄰近節段IDD，這也是手術治療高復發率的原因之一[3]。隨著對髓核細胞退變機制研究的深入以及生物材料的不斷發展，應用細胞技術和組織工程等方法修復退變髓核細胞越來越受到關注?，F就退變髓核細胞修復及組織工程應用的研究進展予以綜述。

1 退變髓核組織的修復

目前髓核細胞退變的機制尚未完全闡明，Notch信號通路可能在髓核細胞退變過程中發揮重要作用，且可能與核因子κB、促分裂原活化的蛋白激酶、Wnt等經典信號通路中的一個或兩個以上信號通路相互拮抗或協同作用。細胞實驗表明，在培養退變髓核細胞中加入部分生長因子或抑制因子可促進退變髓核細胞的修復并可抑制其退變進程[4]。

1.1信號通路對髓核細胞的調控作用 Notch信號通路受體可直接將接收到的鄰近細胞組織信號傳遞至細胞核，并與轉錄因子結合激活Notch信號通路。有研究顯示，髓核內長期存在一個缺氧環境，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α和HIF-2α在髓核細胞中穩定表達，髓核細胞已適應這種缺氧環境，當髓核內氧分壓低于5%時，細胞存活率最大[5]。Hirose等[6]研究發現，抑制髓核內HIF-1的表達可間接抑制HES(hairy enhancer of split)/HEY(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif family members)樣轉錄因子和Notch信號通路轉導的激活因子JAG1(Jagged 1)等參與髓核細胞信息交換的細胞外基質蛋白的表達。曹光彪等[7]通過檢測小鼠椎間盤中的Notch信號表達水平，篩選出DLL-1(一種人源重組蛋白)和JAG1表達變化最顯著的信號分子，而DLL-1、JAG1對軟骨細胞分化起負性調節作用。提示Notch信號通路可通過調控脊柱軟骨終板中軟骨細胞的增殖、分化修復退變的椎間盤。目前國內尚無相關Notch信號在髓核細胞退變中的作用機制研究，但何坤[8]用γ-分泌酶抑制劑阻滯星形膠質細胞Notch信號后發現，白細胞介素(interleukin，IL)-1β、膠質纖維酸性蛋白、血管內皮生長因子的表達均受到抑制，進而影響細胞的增殖、凋亡。潘東晟等[9]研究發現，miR-21可激活退變髓核細胞中沉默的人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，促進磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)磷酸化，從而抑制退變的髓核細胞自噬。張晗祥等[10]利用病毒轉染人體退變髓核細胞中的基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，結果發現，退變髓核細胞可分泌SDF-1，且血管內皮細胞的活性和增殖水平均與SDF-1呈正相關；IDD時，髓核細胞內的聚集蛋白聚糖減少，促進血管和神經纖維長入髓核引起盤源性腰痛，但隨著髓核細胞退變程度的增加SDF-1水平也逐漸升高，更有利于血管、神經的生長，如此形成惡性循環。陳江等[11]用身痛逐瘀湯含藥血清干預靜水壓力建造退變髓核細胞模型，結果發現身痛逐瘀湯可上調磷酸化Akt的表達，抑制胱天蛋白酶-9、糖原合成酶激酶3β蛋白表達。提示身痛逐瘀湯可通過抑制PI3K/Akt信號通路中促凋亡因子的活化轉錄延緩人體髓核細胞退變。

以上研究表明，Notch通路通過調節細胞因子的表達延緩髓核細胞退變、改善營養途徑，從而補充髓核細胞數量。Notch2受體在老年段髓核組織中的表達顯著高于中年齡段的髓核組織[7]，也提示該信號通路可能嘗試自我修復。因此，可通過干預Notch通路、改善髓核細胞營養促進髓核細胞的增殖、分化。

1.2生長因子對髓核細胞的修復作用 各種合成代謝生長因子和細胞因子均可改變椎間盤內平衡，刺激細胞外基質的合成。成骨蛋白1(osteogenicptotein 1，OP-1)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)均可促進髓核細胞蛋白聚糖代謝[12-13]。Liu等[14]向兔椎間盤內注射OP-1后發現，OP-1可促進髓核細胞蛋白聚糖和膠原蛋白的分泌。Takegami等[15]用軟骨素誘導兔體外髓核細胞退變，將OP-1加入兔退變髓核細胞培養基中發現，兔髓核細胞蛋白聚糖可快速恢復至誘導前水平，且經OP-1干預的正常兔髓核細胞蛋白聚糖表達增加。以上研究證實，OP-1可拮抗軟骨素誘導的兔髓核細胞分解代謝，同時OP-1也可促進正常髓核細胞蛋白聚糖表達。

BMP家族和TGF-β超家族主要干預細胞增殖、分化進程。研究發現，將TGF-β與生長分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)聯合作用于髓核工程樣細胞，可促進豐富的聚集蛋白聚糖和富含Ⅱ型膠原的細胞外基質分泌，且髓核工程樣細胞中的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原水平與正常髓核細胞相當[16-17]。張象[18]研究發現，BMP-9可通過抑制髓核細胞Notch信號通路受體Notch1和配體DLL-1的表達，導致NICD-1(Notch1的活性分子)的表達減少，下調靶基因HES1和HES5表達，從而促進細胞外基質分泌增加。魯花等[19]將BMP-9轉染入人髓核細胞內，結果發現轉染腺病毒-BMP-9患者的磷酸化Akt和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的表達均顯著高于正常對照者，而正常對照者的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6和IL-8水平均顯著降低。還有研究證實，TGF-β3與BMP-2可協同誘導髓核間充質干細胞向類髓核細胞分化[20-21]。TGF-β3與BMP-2聯合可顯著促進BMP受體2的表達，同時TGF-β與BMP還可通過磷酸化分別激活Smad2/3和Smad1/5/8信號通路，此外，TGF-β與BMP協同還可同時激活Smad4[22]。

生長因子是促進髓核細胞自我修復的重要組成部分，其生物效應與不同細胞類型、生物環境密切相關，如TGF-β作用于髓核細胞和髓核間充質干細胞發揮不同的生物效應。雖然OP-1、BMP-2、BMP-9、TGF-β等生長因子可通過Notch、PI3K/Akt、Smad信號通路調控髓核細胞細胞外基質的分泌和細胞的增殖凋亡、促進髓核細胞的修復，但仍存在效率低、分化不穩定等問題，因此生長因子與髓核細胞間的復雜作用仍需進一步探究。

1.3抑制因子對髓核細胞的修復作用 某些不包含合成代謝抑制的藥劑正在被用于退變椎間盤的修復。胡凱[23]使用干擾小RNA沉默人體外髓核細胞去整合素-金屬蛋白酶5的表達，然后用環形針穿刺造模，8周后發現正常髓核細胞髓核組織完全消失，而被去整合素-金屬蛋白酶5沉默的髓核細胞則保持原有結構。此外，將IL-1受體拮抗劑作用于體外退變、突出的人椎間盤組織，可導致基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3的表達降低[24]。經IL-1受體拮抗劑預處理和IL-1處理的退變人髓核細胞中的去整合素-金屬蛋白酶4和MMP-3的表達水平均降低[25]。此外，在人體椎間盤中，溶解性的TNF受體與IL-1α可協同上調蛋白聚糖的合成，但溶解性的TNF受體與TNF-α共處理會抑制一氧化氮和IL-6的產生，雖然顯性抑制TNF并不會激活TNF受體，但其可與TNF有效競爭，當顯性抑制TNF與椎間盤細胞的IL-β拮抗時，顯性抑制TNF可下調TNF-α、MMP-3、胱天蛋白酶3、前列腺素E2的表達[26-27]。目前TNF抑制劑已用于臨床坐骨神經痛的治療，但受樣本量的影響，其有效性尚待驗證[28]。p38促分裂原活化的蛋白激酶抑制因子可抑制MMP-3、IL-1的表達并可作為核因子κB的一種誘導劑，將p38促分裂原活化的蛋白激酶抑制因子應用于椎間盤突出模型大鼠可減輕大鼠疼痛[29]。雖然大量抑制因子對椎間盤和周圍組織的影響已被廣泛研究，但受倫理學和安全性的限制，其長期效應問題仍未解決。隨著未來對髓核細胞自噬研究的不斷深入，調節髓核細胞自噬可能成為延緩或逆轉IDD過程的有效方法。

2 組織工程在髓核組織修復中的應用

髓核組織的組織工程與其他組織一樣，需要細胞、載體組織、生長因子或生物信號的復合體，具體選擇則需要依賴于所要修復的組織。由于椎間盤組織始終處于壓力狀態，修復或置換后的組織也需接受機械應力或信號。與修復纖維環相比，應用組織工程修復髓核組織更值得關注，其原因主要在于髓核組織結構較簡單，且髓核退變發生較早，早期干預對延緩IDD意義重大。

2.1自體細胞移植研究 細胞移植治療髓核細胞退變具有巨大潛力和可行性。Meisel等[30]研究發現，將自體軟骨細胞經12周體外培養移植到椎間盤切除節段，結果發現移植的椎間盤軟骨細胞產生的細胞外基質蛋白聚糖含量經番紅O-快速綠染色技術檢驗與正常椎間盤組織相似，免疫組織化學也證實，在再生的椎間盤基質中存在Ⅱ型和Ⅰ型膠原，且含量均高于正常椎間盤組織；此外，經移植處理的椎間盤與周圍組織整合良好，同時患者疼痛程度顯著減輕。Nishimura和Mochida[31]將自體髓核細胞經體外傳代后注入退變椎間盤中，結果發現自體髓核細胞再注入可促進椎間盤內蛋白聚糖、膠原蛋白的合成，同時可維持椎間盤高度，延緩IDD進程。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有強大增殖能力的干細胞，與其他干細胞相比更易獲得，在體外培養12代后仍具有正常體型組和酶活性，且不會自動分化[32]。張寧峰等[33]證實，采用BMSCs培養基培養退變髓核細胞可恢復其活性，并促進蛋白聚糖信使RNA和蛋白以及MMP-3信使RNA和蛋白的表達。白亦光等[32]采用體外分離法培養髓核細胞和BMSCs，并用穿刺抽吸法建立兔IDD模型，造模同時行細胞移植治療，然后將36只5月齡日本大耳白兔隨機分為正常對照組、髓核細胞移植組、BMSCs移植組，結果發現 BMSCs移植組和髓核細胞移植組Ⅱ型膠原、蛋白聚糖信使RNA相對表達水平均顯著高于正常對照組，而正常對照組、髓核細胞移植組和BMSCs移植組比較差異則無統計學意義。還有研究分別將胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、BMP-7、堿性成纖維細胞生長因子、TGF-β加入BMSCs和髓核細胞培養基中，結果發現IGF-1和TGF-β可抑制髓核細胞MMP-2的表達、減少細胞外基質吸收，且兩者具有協同作用；同時，IGF-1和BMP-7還可促進BMSCs向軟骨細胞分泌，增加髓核細胞和蛋白聚糖的表達，有利于恢復椎間盤高度，而堿性成纖維細胞生長因子則可促進BMSCs增殖[34-37]。TGF-β、堿性成纖維細胞生長因子和IGF-1等細胞因子不僅可促進細胞外基質的表達，還可促進微血管的生長[38-39]，但其遠期療效仍有待研究驗證。

細胞移植有助于延緩甚至逆轉髓核細胞退變進程，但高成本、高難度以及椎間盤無血供、免疫保護環境等因素仍限制了其發展。雖然采用轉基因細胞定向分化已取得一定成果，但轉基因定向表達、轉染病毒的免疫性以及轉染方法等問題尚未達成共識。

2.2細胞支架生物復合材料研究 采用合適的細胞支架生物復合材料不僅有利于細胞的生長、增殖，還能減少細胞移植過程中的細胞流失。有研究顯示，良好的細胞支架復合材料不僅要與周圍鄰近椎體快速整合，還能恢復椎間盤正常高度、延緩椎間盤退變[40]。目前研究較多的細胞支架材料主要包括：①生物活性和相容性類似于髓核細胞外基質的天然材料，如藻酸鹽類、瓊脂糖、膠原蛋白、硫酸軟骨素等，此類材料具有與鄰近椎體快速整合、細胞生長繁殖快等優點[41]，但生物力學效應差，不具備髓核的力學性能；②人工復合材料，如聚乳酸、聚羥基乙酸、共聚物和納米纖維復合材料等，這類材料力學特性較好，甚至優于髓核細胞，但其生物毒性對細胞生長、增殖的影響難以控制。王瑾等[42]采用不同膠原支架研究BMSCs的分化，結果發現Ⅰ型膠原、Ⅰ/Ⅱ型混合膠原、Ⅱ型膠原支架均可促進髓核間充質干細胞分化，其中Ⅱ型膠原支架促進髓核間充質干細胞向髓核細胞分化的能力更強。楊斐[43]以寡肽[Nap-F-F-Y(P)]為基本單位組裝成膠并復合硫酸軟骨素制成的超分子水凝膠在微觀結構上與細胞外基質近似，具有良好的黏彈性且生物相容度高，但這類材料對細胞生長擴增的影響還有待研究。夏金健[44]將聚己內酯與聚乳酸-聚乙醇酸共聚物按不同比例混合作為細胞支架材料，結果發現，與單純使用某一類材料相比，混合材料在改善細胞增殖能力、活性以及細胞外基質分泌方面更具優勢。綜上，Ⅱ型膠原是髓核組織工程學用于細胞增殖的理想材料，未來可考慮將力學結構良好的人工材料與Ⅱ型膠原按比例復合，制造出生物性質與椎間盤髓核組織更相似的復合材料。

3 小 結

目前關于退變髓核細胞修復機制的研究雖已取得一定進展，但確切的髓核細胞退變機制仍有待進一步闡明。雖然退變髓核組織工程已廣泛應用于臨床，但仍有許多問題需要解決：①植入細胞、組織及整體椎間盤最佳治療方案尚未達成共識；②生物再生治療受患者病程的影響較大；③腰背痛的發病機制尚不明確；④促進生物修復和椎間盤置換以及術后康復的最佳治療方案目前尚未明確。未來的研究應著重于細胞支架復合材料、細胞移植來源、基因編程等不同方法的交叉互補，實現退變髓核細胞的生物學再生，為腰椎間盤突出患者提供最佳治療方案。