FMR1基因在脆性X綜合征診斷及治療中的應用進展

廖緣，曾曉玲，楊婧

(1.貴州醫科大學，貴州 550004； 2.貴州省人民醫院婦產科，貴州 550004)

脆性X綜合征(fragile X syndrome，FXS)是智力障礙和自閉癥譜系障礙的最常見疾病，男性發生率約為1/5 000，女性發生率為1/8 000～1/4 000，大多數FXS患者表現出注意力缺陷多動障礙、癲癇發作、焦慮和語言延遲等癥狀[1]。FXS的病因主要是脆性X智力障礙1(fragile X mental retardation 1，FMR1)基因啟動子區域的CGG三核苷酸異常重復擴增，正常人中FMR1基因具有6～44個CGG重復，前突變患者有55～200個CGG重復，全突變患者有200個以上的CGG重復，相對于正常人，CGG重復增加會使DNA甲基化，導致組蛋白修飾、染色質重塑和轉錄基因沉默，脆性X智力低下蛋白 (fragile X mental retardation protein，FMRP)丟失，FMRP缺乏涉及大腦中信使RNA(message RNA，mRNA)代謝的多個方面，被認為是FXS表型的直接原因[2]。FXS可采用靶向治療、病因治療和對癥治療，靶向治療會影響涉及FMRP的神經生物學通路，對癥治療主要通過抗精神病藥物對FXS患者的癥狀進行治療，病因治療包括采用染色質修飾酶抑制劑、RNA或基因進行定向基因編輯以恢復FMR1基因表達[3]。目前針對FXS的有效靶向治療進展緩慢，尚無藥物被批準用于FXS的治療，但在臨床研究中有潛力的治療策略正在研究中，現對這些治療策略進行綜述，以期為FXS的治療提供參考。

1 FMR1基因

FMR1基因包含17個外顯子，長度為38 kb，產生4.4 kb的mRNA，通過選擇性剪接產生12種不同的FMRP，分子量為70 000～80 000[2]。FMR1基因包括甲基化區、啟動子區、CGG段和編碼序列，甲基化區域的邊界位于CGG序列上游650～800個核苷酸處，在FXS中此邊界不明顯，主要因為啟動子和CGG段被甲基化[3]。啟動子包括約56個CpG位點(CpG 島)以及位于CGG序列上游約130個核苷酸的3個啟動子樣序列。多態性CGG重復位于外顯子1的5′非翻譯區(untranslated region，UTR)，該序列超過200個可導致DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)識別CpG島，DNMT向CGG序列中的胞嘧啶添加一個甲基，作為異染色質化和基因沉默的信號，甲基化的胞嘧啶被甲基化CpG結合蛋白2識別，CpG結合蛋白2激活組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)，進而去除甲基化的胞嘧啶附近的組蛋白H3和H4 N端區域的乙?；瑥亩鴮е氯旧|凝聚[4]。

2 FXS的治療策略

FMR1基因沉默涉及兩種主要機制：CGG擴增超過200次重復和表觀遺傳修飾(主要是DNA甲基化)，以上機制會導致FMRP缺失，而FMRP缺失會導致FXS表型。理論上根據發生機制可以采用兩種不同的方法治療FXS：①針對由于FMR1缺乏導致的其他信號通路異常進行治療；②恢復FMR1表達，作用于參與轉錄失活的表觀遺傳機制。目前有3個較為有潛力的針對病因的治療方向。第一個治療方向是FMR1基因的藥理學再激活，這些藥物可影響DNA甲基化和組蛋白修飾；第二個方向是用非編碼RNA治療FXS，盡管目前用非編碼RNA治療仍處于發展階段，但已經顯示出巨大的潛力；第三個方向是基因治療，主要根據基因組的變化治療FXS。研究表明，對CGG重復進行靶向基因組的編輯會導致FMR1啟動子DNA完全去甲基化，并隨后重新激活該基因[2]。

2.1基于FMR1基因的治療策略

2.1.1地西他濱 地西他濱是一種去甲基化劑，已被包括美國食品藥品管理局和歐盟委員會在內的多個監管機構批準用于血液系統惡性腫瘤的治療[5]。地西他濱是激活FMR1基因表達的代表藥物，可以抑制DNMT，目前已在人類中鑒定出3種活性DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，地西他濱可以插入到胞苷的位置，與DNMT1以共價鍵不可逆地結合，并在細胞分裂過程中導致DNA去甲基化[5]，但地西他濱對基因組DNA的去甲基化作用僅限于特定區域。經地西他濱治療7 d后，重新激活FMR1轉錄的效果可持續1個月，且轉錄水平在使用地西他濱后10～15 d達到峰值[6]。高劑量的地西他濱會迅速引起DNA損傷和細胞毒性，患者可發生惡心、嘔吐、腹瀉以及中性粒細胞減少等不良反應[7]，這些不良反應極大地限制了地西他濱的使用劑量和治療時間，故限制了地西他濱的應用。

2.1.2HDAC抑制劑 在FXS動物模型中，使用DNMT抑制劑進行全身治療會導致組織中FMR1表達增強[8]。HDAC抑制劑具有獨特的結構，針對全突變患者的淋巴母細胞使用3種可誘導組蛋白過度乙酰化的藥物(4-苯基丁酸、丁酸鈉和曲古抑菌素A)進行治療時，FMR1基因被重新激活，與單獨使用地西他濱相比，上述藥物與地西他濱聯用可使FMR1 mRNA水平提高2～5倍，組蛋白過度乙酰化與DNA去甲基化在FMR1基因重新激活過程中具有明顯的協同作用[9]。經美國食品藥品管理局批準的HDAC抑制劑，如羅米地辛、伏立諾他等，在FXS細胞中僅具有較弱的FMR1基因重新激活效果，且僅針對部分細胞，大部分HDAC抑制劑會誘導高水平的細胞毒性，因此HDAC抑制劑不具有作為治療FXS藥物開發的潛力[10]。

2.2針對非編碼RNA的治療策略 非編碼RNA是一類非蛋白質編碼RNA和功能性RNA分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、干擾小RNA等。非編碼RNA參與人類多種疾病的發生發展。FXS的發病主要由RNA結合的FMRP丟失引起[11]。FMRP與神經細胞樹突中的mRNA相互作用，從而調控突觸的可塑性，并抑制突觸蛋白質翻譯。此外，FMRP還參與RNA干擾通路，并通過與不同miRNA相互作用調節重要神經生物學通路受體亞基的翻譯[12]，如FMRP與miR-125b相互作用以調節N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基的表達，進而影響突觸可塑性；FMRP與miR-125a的相互作用可逆地抑制突觸后密度蛋白-95 mRNA的翻譯，而突觸后密度蛋白-95是谷氨酸受體定位的重要影響因素[13]。RNA干擾過程與組蛋白或DNA甲基化作用之間的關聯涉及轉錄抑制，其中一些基因的轉錄抑制在FXS中較為常見[14]。研究發現，RNA干擾途徑參與擴展CGG重復甲基化的過程，miRNA由包含CGG重復(rCGG)的切割的雙鏈RNA產生，該結論基于rCGG可由RNase Ⅲ酶切割，且完全突變的CGG重復在早期胚胎發育過程中被轉錄[15]。此外，Suhl等[16]發現，1例非完全突變但3′UTR存在突變的患者神經細胞中FMRP表達水平降低，且miR-130b與突變基因中的3′UTR結合導致FMRP表達降低。在斑馬魚模型中發現，FMR1轉錄本與FMR1-miRNA水平呈負相關，在某些條件下，FMR1-miRNA表達的增加可誘導FMR1基因啟動子區域的DNA高甲基化，導致FMR1基因轉錄失活和FMRP表達降低[17]。miR-219和miR-960在果蠅模型中發現，其中miR-219通過與3′UTR結合降低FMR1基因表達，表明該miRNA直接參與FXS的發病[18]。

非編碼RNA(如lncRNA)通路可以影響染色質重塑和基因表達過程[19]。lncRNA與許多染色質修飾酶相關，這些酶可以調控組蛋白或DNA與染色質的相互作用，從而影響遺傳信息的表達[19]。在FXS中觀察到多種lncRNA，如FMR4、FMR5、FMR6、反義FMR1等，在這些lncRNA中，FMR6是一種與FMR1外顯子15-17重疊的剪接反義定向lncRNA，可能參與調節FMR1基因轉錄，且FMR6可能與FMR1 3′UTR中miR-19a和miR-19b的結合位點重疊，通過miRNA途徑介導FMRP的有效翻譯[20]。

某些非編碼RNA(如干擾小RNA和lncRNA)通過參與染色質重塑和DNA甲基化過程調節基因的表達和基因組穩定性，這些非編碼RNA對研究FXS的治療藥物有指導意義。目前部分針對miRNA的藥物正處于臨床試驗中，如miRNA模擬物、miRNA抑制劑等[21]。由于FMR1基因及其基因產物參與不同的非編碼RNA通路，因此靶向非編碼RNA通路可成為治療FXS的靶標。雖然目前尚未開發出基于miRNA抑制劑的FXS治療方法，且缺少關于FMR1基因敲除小鼠的實驗數據，但由于CGG重復甲基化和異染色質化在FXS發病機制中的重要作用，因此可以基于非編碼RNA的作用開發FXS的治療方法。非編碼RNA主要作為FMRP表達的負調控因子，通過降低CGG重復甲基化水平使基因表達正常化，且miRNA抑制劑可通過降低miRNA水平刺激FMRP表達增加[21]。

2.3病毒載體介導的FXS基因治療策略 基因治療是現代生物技術和醫學中最有前途的研究領域之一，這種方法適用于治療由基因組變化導致的無法治愈的疾病。基因治療目前已被引入臨床，諾華公司開發的Zolgensma于2019年5月獲得美國食品藥品管理局批準用于治療脊髓性肌萎縮癥[22]。

研究顯示，在FMR1基因敲除小鼠中提高FMRP的表達可以挽救部分FXS表型缺陷，如大睪丸、焦慮和聽覺反射性癲癇發作的易感性，將人類FMR1的互補DNA或包含整個FMR1基因的酵母人工染色體引入小鼠可誘導FMRP表達[23-25]。在一項關于使用含有FMR1編碼序列的重組腺相關病毒(FMR1-AAV5)的研究中，將FMR1-AAV5載體注射到FMR1基因敲除小鼠的海馬體可以改善小鼠的長期抑郁，而該病癥與突觸可塑性異常有關[26]。另一項研究將含有神經元特異性的突觸蛋白1啟動子的FMR1-AAV9載體注射到5日齡FMR1基因敲除小鼠的側腦室發現，FMRP在多個前腦區域表達，但在注射部位的遠側和尾部區域未檢測到FMRP的表達，且可逆轉小鼠異常的重復行為，但運動過度、超聲波發聲和聽覺反射性癲癇等癥狀并未消除[27]。后續研究發現，FMRP的表達水平在前腦結構中最高，在中樞神經系統和尾部等區域較低[28]。研究顯示，FMR1-AAV9治療逆轉了小鼠的焦慮狀態和聽覺驚嚇反應，并部分逆轉了運動過度；在生化方面，突觸后密度蛋白-95和轉錄調節劑甲基化CpG結合蛋白2的表達改善[27]。較高水平的FMRP可改善FMR1基因敲除小鼠的部分癥狀，表明當FMRP表達水平是野生型FMRP表達水平的35%～115%時可以治療表型缺陷[28]。

2.4基于成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技術的基因療法 CRISPR是一類重復的DNA序列，與CRISPR相關基因協同作用，使細菌獲得抵抗噬菌體和質粒DNA的免疫力。在這種免疫反應過程中，入侵的DNA首先被切割并整合到CRISPR基因組中，然后該基因組被轉錄為單個非編碼前體CRISPR RNA，并進一步加工成成熟的短片段，成熟的短片段最終與內切核酸酶Cas9形成核糖核蛋白復合物，后者識別并切割入侵的DNA。采用CRISPR技術進行基因編輯是基因治療研究的最新方向，目前已有學者將CRISPR用于FXS的治療。在體外實驗中，CRISPR技術導致了具有FMR1基因的完全突變的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)中CGG重復序列的減少，這些細胞用編碼Cas9的質粒進行電穿孔，并使用單導向RNA(single guide RNA，sgRNA)靶向CGG重復序列上游的序列末端，在2%～3%完全突變細胞中CGG重復序列被完全刪除，且細胞基因啟動子發生去甲基化，重新激活FMRP的表達[29]。使用兩個sgRNA靶向三核苷酸重復上游和下游的序列可以導致約67%CRISPR編輯的雜交克隆系和20%的人類FXS iPSC克隆系基因的重新激活，重新激活的克隆系在啟動子區域表現出低水平的DNA甲基化，而未激活的細胞表現出原本的甲基化水平，這可能是由細胞復制后不完全再甲基化所導致，因此分裂越活躍的細胞越有可能表現出有效的FMR1再激活[30]。

失活Cas9-DNA甲基化羥化酶(nuclease-dead mutants of Cas9-tet methylcytosine dioxygenase 1，dCas9-Tet1)是一種編輯工具，包含催化失活的Cas9(dCas9)和Tet1，Tet1是一種誘導胞嘧啶去甲基化的酶，通過慢病毒轉導dCas9-Tet1/sgRNA逆轉CGG重復序列的超甲基化，可在體外重新激活iPSC，進而重新激活FMR1的表達，并以最小的脫靶效應恢復iPSC中FMR1啟動子的活性；修復了iPSC衍生神經元的異常電生理表型，移植到小鼠大腦后維持了編輯過的神經元中FMR1的表達，且有絲分裂后FXS神經元中CGG重復序列的去甲基化重新激活了FMR1(盡管效率低于FXS iPSC)，并逆轉了小鼠的自發性過度活躍狀態[29]。通過類似的方法，有學者將dCas9與轉錄激活因子VP192融合后在體外導入FXS人類胚胎干細胞和神經祖細胞，從而靶向重新激活FMR1基因，雖然這種方法在這些細胞中實現了較好的轉錄再激活效果，但并未觀察到FMRP表達的顯著增加，且與靶向啟動子的sgRNA相比，靶向CGG的sgRNA能夠誘導更高水平的轉錄活性[1]。在FXS小鼠模型中進行的首次體內基因編輯實驗中，使用金納米粒子將Cas9和Cpf1核酸酶遞送到成年小鼠的大腦以靶向代謝性谷氨酸受體5基因編碼代謝性谷氨酸受體5蛋白，在顱內注射編輯工具后，局部紋狀體代謝型谷氨酸受體5水平降低，小鼠的過度重復行為得到改善[31]。

3 FMR1基因在FXS診斷中的應用

FXS的主要病因是位于X染色體(Xq27.3)上的FMR1發生突變，進而引起表觀遺傳上的修飾改變，導致相應的基因功能沉默，造成基因失活，從而引起一系列多系統的機體、行為和智力的改變[2]。FXS患者目前尚缺少針對性、有效的治療方法，針對高危人群進行篩查及診斷是行之有效的方法。FXS癥狀不具有特異性，因此診斷難度較大。目前，男性FXS患者的平均診斷年齡為3歲，女性更晚[32]，早期診斷不僅可以實現早期干預和治療，還可以減輕家庭壓力。因此，對FXS進行準確、有效的早期診斷十分重要。

3.1FXS的診斷原理及方法

3.1.1基于FMR1基因突變的檢測 美國醫學遺傳學和基因組學學院建議，對所有出現精神發育遲緩、智力障礙和(或)行為問題的個體進行FXS檢測[33]。Southern印跡分析和聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)通常用于估計FMR1基因CGG重復的大小和甲基化，兩種方法聯合檢測是FXS分子診斷的“金標準”。多年來，基于PCR的分析方法得到改進，目前的方法可更精確地估計重復序列的大小、AGG的中斷和甲基化狀態，所需樣本量更小，成本效益更高[33]。對于臨床表型提示可能是FXS但CGG擴增呈陰性的個體，測序和多重連接依賴探針擴增等可用于識別拷貝數變異和單核苷酸差異[34]。在前突變和完全突變的女性攜帶者中，還需要確定影響臨床表型的X-失活率(X染色體失活細胞的百分比)[35]。

3.1.2定量FMR1 mRNA和FMRP 根據CGG重復的大小，未甲基化的等位基因可能會產生部分FMRP，從而導致較輕的FXS表型，同時未甲基化的完全突變等位基因可產生FMR1 mRNA，其與FXS的毒性相關[36]。因此，測量FMR1的轉錄水平和FMRP水平對臨床診斷有幫助，同時兩者也可作為臨床試驗設計中患者分層的依據。逆轉錄PCR技術廣泛用于測量FXS患者外周血和其他細胞類型中的FMR1 mRNA水平，而高通量測序是測量細胞裂解液和干血斑中FMRP的高靈敏度檢測方法[36-37]。但這些檢測方法是基于甲基化程度和嵌合現象的組織差異，無法確定外周樣本(如血液和唾液)中測量水平是否能夠準確反映大腦的水平。

3.2產前診斷 母系遺傳是FXS常見的遺傳模式，但男性攜帶者以及前突變者隱藏的風險仍不可忽視，產前篩查是防止FXS患兒出生的第一道防線。當孕婦已被證實為FXS攜帶者時，應當進行產前診斷。在我國，針對FXS的產前診斷遠低于唐氏篩查，也只有極少數國家將FMR1基因篩查納入孕婦的常規檢查[38]。大多數國家建議針對CGG重復≥60的孕婦進行產前診斷，產前診斷可于妊娠10～12周進行絨毛活檢或妊娠16～18周進行羊水穿刺，但由于妊娠前3個月FMR1基因甲基化不完全導致Southern印跡分析不易區分前突變和完全突變，因此還需要在孕中期進行羊水穿刺[39-40]。

4 小 結

藥理學治療方法是治療疾病最常見和被普遍接受的方法，但基于分子生物學的治療方法已經被開發并逐漸進入臨床實踐。FXS基因治療是通過直接編輯CGG重復序列或傳遞誘導去甲基化的酶治療疾病，基因治療在FMR1基因重新激活方面具有較好的效果。目前，基因編輯在細胞系和動物模型中效果明顯，部分藥物已進入臨床試驗階段。由于FXS對患者家庭及社會都會產生較大的壓力和經濟負擔，因此要加強高危孕婦的產前診斷及咨詢服務，推廣普及FXS相關知識，有效降低FXS的發病率，改善患者的生活質量。