氮添加對樂山大佛裸露巖石與地衣覆蓋巖石表面細菌群落結構的影響

陳旭黎,吳福佳,孫 博,楊天宇,宋會興,*

1 四川農業大學風景園林學院, 成都 611130

2 中鐵西北科學研究院有限公司,蘭州 730000

3 樂山大佛景區管理委員會石窟研究中心,樂山 614003

氮是陸地生態系統最重要的營養元素之一,與碳、硫、磷等元素循環密切相關[1],氮缺乏/氮制約是巖石風化成土過程的普遍現象[2]。與森林生態系統氮元素的主要來源是動植物遺體的分解與腐爛不同[3],大氣氮沉降[4]與生物固氮[5]是巖石表面微生境氮元素的主要來源。當前,大氣氮沉降對陸地生態系統土壤細菌群落的影響已有許多報道[6—7],發現氮沉降增加可造成變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度增加的同時,降低酸菌門(Acidobacteria)和Verrucomicrobia的相對豐度,引起細菌群落結構及功能的轉變；土壤細菌群落對氮沉降的響應動態隨著地上植被的變化而變化[8]?，F有研究多是以草原、森林等植被演替后期系統為對象,氮沉降對植被演替初期——巖石風化成土過程影響的信息較少。

巖石風化成土過程包括物理、化學和生物風化過程,而細菌群落在巖石風化初期可能發揮了主導作用[9]。細菌引起的巖石生物風化速率可達非生物風化速率的14倍以上[10]。研究認為,光合細菌(Photosynthetic Bacteria)利用光能將無機碳(CO2)同化為有機碳,在巖石表面沉積并富集,為裸露巖石表面包括需氧微生物、厭氧微生物在內的微生物群落的形成創造了養分條件[11]。微生物在生長代謝過程中產生的有機酸如甲酸、乳酸、葡萄糖酸、琥珀酸、檸檬酸等可以通過羥基和羧基產生不平衡的陽離子和陰離子加速巖石礦物的溶解速率[12],也可以通過羧基、羥基以及其它官能團螯合巖石析出的金屬離子,影響巖石的穩定性[13]。近年來,有直接證據顯示,細菌還能夠以富含還原態鐵的黃鐵礦、黑云母、角閃石等為食物,通過亞鐵離子的氧化還原過程獲取能量,加速巖石的風化分解[14]。因此,研究不同風化階段的巖石表面細菌群落變化對于理解巖石風化過程和機制具有重要意義。

樂山大佛是世界上最大的古代石刻彌勒佛坐像,始鑿于唐開元初年(公元713年),歷時90年建成,是唐代石刻藝術創作的代表作品,具有極高的歷史價值、藝術價值與科學價值,于 1996 年12月與峨眉山自然保護區一起被聯合國教科文組織列為“世界文化與自然遺產”。歷經千余年的日曬雨淋,樂山大佛風化嚴重[15],藻菌共生體對樂山大佛砂巖風化的影響受到關注[16]。前期研究表明,藻菌共生體(地衣)覆蓋的樂山大佛佛體表面與裸巖表面的土壤細菌群落明顯不同[17]。石生地衣通過物理、化學以及生物化學等多種方式顯著影響巖石基質,是巖石成土過程的重要環節,亦是石質文物保護面臨的普遍問題[12]。中國亞熱帶地區是受氮沉降影響嚴重的區域[18]。因此,大氣氮沉降是否影響樂山大佛佛體風化？過程與機制是什么？亟待深入研究。

1 研究區域概況

樂山大佛位于四川省樂山市,鑿造在大渡河與岷江交匯處的凌云山棲鸞峰紅砂巖上(29°32′47″N, 103°45′48″E),海拔354—435 m。地處亞熱帶濕潤季風氣候區,降水充沛,年均降水量約為1291.6 mm。降水主要集中于夏季,占全年降水的58%。年均蒸發量1057 mm,相對濕度達81%。大佛周圍植被類型為亞熱帶常綠闊葉林,以栲屬(Castanopsisspp.)、青岡屬(Cyclobalanopsisspp.)和木荷屬(Schimasuperba)為主。

2 研究方法

2.1 試驗設計與大氣氮沉降模擬處理

選擇與樂山大佛佛體巖性、風化現狀一致的紅砂巖裸露的巖石(NR)和地衣覆蓋的巖石(LR)為處理對象進行氮沉降模擬。基于四川盆地氮沉降特征[19],以全年實際氮濕沉降量的2倍值為最大預測值,按照成倍遞減的方式設置氮添加量,以NH4NO3為氮源,設置5個處理梯度,依次為0 kg hm-2a-1(N0,對照)、9 kg hm-2a-1(N1)、18 kg hm-2a-1(N2)、36 kg hm-2a-1(N3,實際值)、72 kg hm-2a-1(N4),每一個氮處理濃度下均設置3個重復樣方,共計30個處理樣方,每個樣方面積2×2 m2。

依據區域年降水量、月降水量分布分別計算各個樣地需要噴灑的硝酸銨溶液濃度與噴施量。自2018年10月起,每月上旬選擇晴朗天氣使用手持式電動噴霧器完成對每個試驗樣地的噴灑處理。為避免樣地間的相互影響,各樣地間保留1.0 m以上的緩沖帶。持續處理12個月。

2.2 樣品采集

于2019年10月上旬完成采樣。采用無菌刀從各樣方多點采集40 g左右表土,均勻混合后裝于無菌塑封袋內,每個處理樣方采集1份樣本,共計30個樣本,均放入裝有冰袋的采樣箱當天運回實驗室。每個樣本均平均分為兩份,一份自然風干,以供化學性質的測定,另一份在4 ℃環境中去除動植物殘體、石礫等雜質,大塊的樣品搗碎,過2 mm篩,做好標記,保存于-80 ℃冰箱以供后續測序分析。

2.3 土壤化學性質測定

土壤樣品經風干、研磨、去雜、過篩后,采用電位法(水土比2.5∶1)測定pH(PHS- 3C, LEICI, Shanghai, China)；采用K2Cr2O7-H2SO4氧化、FeSO4滴定法測定土壤總有機碳(TOC)含量；采用濃硫酸消煮、凱氏定氮法測定全氮(TN)含量(KND, Top Ltd., Hangzhou, Zhejiang, China)；全磷(TP)含量采用HClO4-H2SO4氧化、鉬銻抗比色法測定[20]。

2.4 DNA提取和PCR擴增

根據E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行樣本總DNA抽提,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量,使用NanoDrop2000測定DNA 濃度和純度。使用338F[21](5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R[22](5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區進行 PCR 擴增。

2.5 Illumina MiSeq測序和生物信息學分析

將同一樣本的聚合酶鏈反應(PCR)產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行回收產物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer(Promega, USA)對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫。利用Illumina Miseq PE300(Illumina, CA, USA)平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

原始數據經過質控過濾以及序列校正后得到優化序列。在NR和LR風化階段,分別共得到863654和925088條高質量細菌Illumina測序序列；每個樣本分別平均獲得57577和61673條序列。使用UPARSE[23]軟件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1)對每個操作分類單元(OTU)進行去重、聚類和嵌合體檢測并按照97%相似性[23—24]對非重復序列進行OTU聚類,從而得到OTU的代表序列。利用RDP classifier[25](http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋,并根據Silva 16S rRNA數據庫進行比對,設置比對置信度閾值為70%。

2.6 數據處理與分析

采用mothur (Version v.1.30.1)計算細菌α-多樣性Sobs和Shannon指數。采用SPSS(Version 20.0, IBM, New York, NY, USA)軟件,利用單因素方差分析和student′s t-檢驗比較不同施氮處理間的差異顯著性(P<0.05)；采用雙因素方差分析研究了風化階段和氮添加及其相互作用對土壤化學性質和細菌多樣性指數的影響；使用Origin 2019軟件進行圖形繪制。采用QIIME和Bray-Curtis距離矩陣對細菌β-多樣性進行主坐標分析(PCoA),并通過相似性分析(ANOSIM)檢驗不同組間細菌群落的差異,利用R語言(Version 3.2.3)繪制PCoA圖。利用LEfSe[26]軟件進行線性判別和效應量分析。

3 研究結果

3.1 氮添加對裸巖和地衣覆蓋巖石表面土壤化學性質的影響

研究結果表明,風化階段對土壤TOC含量有顯著影響(P<0.001),地衣覆蓋的巖石表面土壤TOC含量在不同施氮水平下均高于裸巖,但氮添加對土壤TOC含量影響不顯著(表1,圖1)。風化階段和氮添加均對土壤TN和TP含量有顯著影響(P<0.01),地衣覆蓋的巖石表面土壤TN和TP含量均高于裸巖,且氮添加增加了裸巖和地衣覆蓋的巖石表面土壤TN和TP含量(表1,圖1)。風化階段對土壤pH值無顯著影響,但氮添加對土壤pH值影響顯著(P<0.001),且裸巖和地衣覆蓋的巖石表面土壤pH值均隨著施氮濃度的增加呈降低趨勢(表1,圖1)。

表1 不同風化階段和氮添加處理及其交互作用對土壤化學性質和細菌α-多樣性指數影響的雙因素方差分析

圖1 不同氮添加處理對NR和LR土壤化學性質的影響

3.2 氮添加對巖石表面細菌群落α-多樣性的影響

在裸露的巖石表面,氮添加對細菌的豐富度指數和多樣性指數均無顯著性影響(圖2)。在地衣覆蓋的巖石表面,N4、N3和N2處理均顯著降低了Sobs指數值(圖2)。

圖2 不同氮添加處理對NR和LR細菌α-多樣性的影響

3.3 氮添加對細菌群落β-多樣性的影響

對裸巖和地衣覆蓋巖石表面細菌群落的β-多樣性分析結果表明,氮沉降對裸巖和地衣覆蓋的巖石細菌物種組成均有顯著影響(NR:P=0.002; LR:P=0.001)(圖3),且對地衣覆蓋的巖石細菌群落組成差異的影響大于裸巖(LR:R=0.822 ; NR:R=0.464)?；贐ray-curtis距離算法的PCoA分析結果顯示,在裸巖表面,PC1和 PC2軸共解釋了細菌群落OTU信息的44.60%；與對照相比,低氮處理(N1—N3)顯著改變了裸巖表面細菌群落組成,且高氮(N4)處理與低氮處理對細菌群落組成的影響不同(R=0.464;P=0.002)(圖3)。在地衣覆蓋的巖石表面,PC1和 PC2軸共解釋了細菌群落OTU信息的68.12%；細菌群落在不同氮添加(N0—N4)處理下均發生了明顯變化(R=0.822;P=0.001)(圖3)。

圖3 基于NR和LR細菌物種組成的主坐標(PCoA)分析

3.4 氮添加對細菌群落物種組成的影響

裸巖表面的優勢菌群以變形菌門(Proteobacteria)(36.75%)和放線菌門(Actinobacteria)(18.55%)為主,其次為綠彎菌門(Chloroflexi)(11.44%)、厚壁菌門(Firmicutes)(10.75%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(6.13%)、WPS- 2(4.54%)、Patescibacteria(3.76%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(3.53%)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(1.42%)。地衣覆蓋的巖石表面是優勢菌群為放線菌門(32.07%)和變形菌門(29.66%),其次是綠彎菌門(14.98%)、WPS- 2(7.46%)、酸桿菌門(7.33%)、浮霉菌門(2.95%)、Patescibacteria(2.70%)、厚壁菌門(1.16%)和擬桿菌門(0.38%)(表2)。

在裸巖表面,變形菌門、放線菌門和Patescibacteria的相對豐度在氮添加處理后發生顯著變化：與對照相比,變形菌門的相對豐度在N4處理下顯著下降；放線菌門和Patescibacteria的相對豐度分別在N2和N3處理下顯著增加(表2)。

在地衣覆蓋的巖石表面,除了綠彎菌門,主要細菌類群在各氮添加處理中均與對照產生顯著性差異。放線菌門與擬桿菌門相對豐度隨氮添加量的增大而下降：N2處理時放線菌門相對豐度顯著低于對照；擬桿菌門相對豐度在N1處理時與對照有著顯著差異。變形菌門、WPS- 2、酸桿菌門、浮霉菌門、Patescibacteria和厚壁菌門在氮添加后均呈增加趨勢：變形菌門和WPS- 2相對豐度趨勢一致,在氮添加后呈上升趨勢,N4處理顯著高于對照；酸桿菌門和浮霉菌門的相對豐度則在N3處理時顯著高于對照；Patescibacteria的相對豐度則在N1、N3和N4處理中均顯著高于對照；厚壁菌門在N2 、N3和N4處理中顯著高于對照(表2)。

表2 不同氮添加處理下門分類水平上各物種的相對豐度(平均值±標準差)

線性判別效應量分析(LEfSe)分析可識別不同氮添加處理下具有統計學差異不同分類水平的細菌類群,并通過張性判別分析(LDA)估算差異類群對組間響應的大小,從而篩選出不同分組間的生物標記物(Biomarker)。分析結果表明,不同氮添加處理組間的微生物類群存在顯著差異(LDA>4；P<0.05)。通過進化分支圖(Cladogram)分析(圖4)發現,在裸巖表面,N2和N4處理下出現了指示細菌類群：N2處理的指示類群來自同一個分支,包括o_Rhizobiales、f_Rhizobiaceae和g_unclassified_f_Rhizobiaceae；N4處理的指示類群來自兩個分支：一個分支包括o_IMCC26256、f_norank_o_IMCC26256、g_norank_f_norank_o_IMCC26256,另一個分支的指示細菌為g_Chujaibacter。

在地衣覆蓋巖石表面,對照組與氮添加處理組均出現了相應的細菌指示類群(圖4)。N0處理的指示類群來自兩個分支：一個分支包括p_Actinobacteria、c_Actinobacteria、o_Pseudonocardiales、f_Pseudonocardiaceae和g_Crossiella,另一個分支為o_Frankiales；N1處理的指示細菌為g_Endobacter；N2處理的指示類群來自同一個分支,分別為o_Corynebacteriales、f_Mycobacteriaceae和g_Mycobacterium；N3處理下的指示類群來自5個分支,第一分支的主要指示細菌為o_IMCC26256,第二分支為c_Gammaproteobacteria,第三分支為g_norank_f_Acidobacteriaceae_Subgroup_1,第四分支主要包括p_Patescibacteria、c_Saccharimonadia和o_Saccharimonadales,第五分支主要包括o_Gemmatales和f_Gemmataceae；N4處理的指示類群主要來自兩個分支,其中一個分支主要包括o_Acetobacterales和f_Acetobacteraceae,另一分支包括o_Xanthomonadales、f_Rhodanobacteraceae和g_Chujaibacter。

圖4 不同氮添加水平下細菌各分類水平物種的線性判別效應量分析(LEfSe)分析

4 討論

化石燃料的消費,交通、工業與生活垃圾排放的增加,均加劇了空氣污染,尤其是含氮化合物的增多(例如NH3、 NO2和NO)[27]。含氮化合物與水蒸氣相互作用,沉積于巖石表面,影響巖石表面的生態過程[28]。本研究發現,大氣氮沉降對樂山大佛裸巖與地衣覆蓋巖石表面土壤細菌群落產生了不同的影響。

4.1 氮添加對細菌群落多樣性的影響

氮添加影響了地衣覆蓋巖石表面土壤細菌群落的α-多樣性(圖2)。通常認為,低濃度的氮添加增加土壤有效氮含量,提升植物的凈初級生產力[29],導致進入土壤的凋落物與根系沉積物增多,促進微生物群落的豐度和多樣性[30]。土壤細菌群落Shannon指數在低氮(N1)添加時的增加可能是增加了巖石表面附生細菌養分來源的原因[31]。在高氮添加(N4)時,細菌群落α-多樣性低于對照,這一方面可能是由于氮添加改變了表層土壤氮的有效性,促進地上植物對養分的需求,導致地下微生物養分的獲取受到限制,從而抑制微生物生長[32]。另一方面,細菌群落豐度的降低還與高氮輸入造成的土壤pH降低有關(圖1)。土壤pH降低可誘發土壤微生物的鋁毒性[33],從而降低土壤細菌群落的豐富度[34]。

然而,氮添加對裸巖表面細菌群落的多樣性和豐富度均沒有產生顯著性影響(圖2)。在裸露的巖石表面,植被缺乏使得碳輸入增加的可能性極小,這使得地衣覆蓋的巖石表面土壤TOC含量高于裸巖(圖1)。這進一步證實了氮添加對土壤微生物的影響與土壤中碳含量有關[35]：當土壤碳充足時,添加氮會顯著促進土壤微生物的生長。相較于地衣覆蓋的巖石,裸巖缺少有機碳輸入途徑,即使氮沉降增加,也難以形成或促進系統內部生態循壞,從而不會對微生物的多樣性產生顯著性影響。此外,裸巖缺乏生物體的覆蓋,基質對額外輸入的氮保留能力弱,絕大部分氮淋失,這也是導致裸巖表面細菌多樣性對氮添加響應不顯著的原因之一。

4.2 氮沉降對細菌群落組成的影響

巖石的風化成土過程(原生演替)受到立地生物條件(基質、氣候和地形)和生物因素(植物物種 、到達順序以及種間相互作用等)的影響[36]。在佛體表面,即使開鑿時間一致,也因為微地形等因素造成樂山大佛不同部位巖石風化程度不同。盡管缺乏維管植物發達的根系和根系介導的微生物群落效應,但地衣的存在會影響巖石/基質溫度、濕度以及碳氮有效性[37],對微生物群落產生有利或不利的影響,地衣覆蓋的樂山大佛巖石表面土壤細菌群落與裸巖表面有著顯著的不同[17]。此外,裸巖生境中細菌養分來源更多依賴于風吹、遠古或者微生物固定來源的碳和氮[38]。這種養分供給的偶然性和不確定性,也是裸巖與地衣覆蓋巖石表面細菌群落對大氣氮添加不同響應的原因(圖3)。

4.3 氮沉降對巖石風化過程的潛在影響

石質文物風化過程與石質文物表面微生物群落結構、豐度和多樣性直接相關[46—47]。盡管氮添加對樂山大佛裸巖表面細菌群落的α-多樣性沒有產生顯著性影響,但放線菌相對豐度在氮添加后顯著增加(表2)。放線菌是石質文物生物腐蝕研究中經常提及的類群,它們在巖石表面形成白色生物膜,產生水溶性深色染料,對文物色彩及結構造成損傷[48—49]。大氣氮沉降對放線菌的影響預示著樂山大佛裸露巖石在未來氣候條件下面臨更嚴重的生物風化影響。在地衣覆蓋巖石表面,細菌群落α-多樣性指數在氮添加后呈降低趨勢,但變形菌門、WPS- 2、酸桿菌門、浮霉菌門、Patescibacteria和厚壁菌門的相對豐度在氮添加后顯著增加(表2)。厚壁菌門是影響磚石風化的重要微生物類群[46]；隸屬厚壁菌門的芽孢桿菌屬(Bacillus)通過產生自乳化活性酸和表面活性劑,具有加速巖石降解的能力[49]。微生物對文化遺產的降解能力除了與遺傳多樣性相關外,還取決于它們形成生物膜的能力[47]。變形菌門物種通過合成有機化合物促進巖石表面生物膜的形成與發展,造成文化遺產材料的微生物退化[50]。此外,真菌是地衣的組成部分,細菌與真菌在氮添加后通過建立相互聯系的動態群落和生物膜系統以適應和抵抗外界惡劣環境,促進群落的生存和演替,從而進一步增加石質文物的風化風險。

5 結論

通過氮添加模擬實驗,對樂山大佛裸巖與地衣覆蓋巖石表面土壤細菌群落響應未來大氣氮沉降特征進行了研究。大氣氮沉降對樂山大佛裸巖和地衣覆蓋的巖石表面細菌群落組成均產生了顯著影響。相較于裸巖,地衣覆蓋的樂山大佛巖石細菌群落受氮沉降的影響更顯著；在不同的巖石表面,即使是同一類群對氮添加的響應趨勢也并非完全相同；線性判別和效應量分析分別發現了裸巖和地衣覆蓋巖石表面7個和21個在氮添加后的細菌指示類群。研究結果暗示,地衣覆蓋的巖石在未來氣候變化中受到環境的影響較裸巖更大。由于菌群功能信息的不足,未來氮沉降對樂山大佛文物風化的影響趨勢尚需進一步的研究。