宏基因組二代測(cè)序在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的應(yīng)用

賈立斌，鄭 榜，汪光柱，李潤(rùn)卓，杜工亮

（1.西安醫(yī)學(xué)院研究生部，陜西 西安 710021；2.陜西省人民醫(yī)院急診外科，陜西 西安 710068）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染性疾病。在2019 年，全球約有1000 萬人感染TB，造成了極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是MTB 感染腦膜、脊膜誘發(fā)的亞急性或慢性非化膿性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病[2]，是肺外結(jié)核最嚴(yán)重的一種類型[3]。TBM 多起病隱匿，早期的臨床表現(xiàn)與其它類型腦膜炎相似，均可出現(xiàn)發(fā)熱、頭疼、嘔吐等癥狀，而頸項(xiàng)強(qiáng)直、意識(shí)障礙等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、體征則出現(xiàn)較晚；同時(shí)腦脊液抗酸染色涂片（acid-fast bacilli，AFB）、腦脊液MTB培養(yǎng)等方法靈敏度低、消耗時(shí)間長(zhǎng)[4]。GeneXpert MTB/RIF（簡(jiǎn)稱XpertMTB/RIF）是一種基于核酸擴(kuò)增的肺外結(jié)核檢測(cè)技術(shù)，具有快速、自動(dòng)及靈敏度較高的優(yōu)勢(shì)，但其特異度較低，不能用做排除診斷[5]，而且這些檢測(cè)方法在成人、兒童及合并人體免疫缺陷病毒感染（human immunodeficiency virus infection，HIV）者中的診斷效能亦不盡相同[6]，均給TBM 的早期診斷帶來了極大的挑戰(zhàn)。宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一種高通量、無偏倚對(duì)樣本中所含脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）進(jìn)行平行測(cè)序，再通過生物信息分析得出病原微生物信息的技術(shù)，包括樣本采集、核酸提取、文庫(kù)制備、測(cè)序、生物信息分析及報(bào)告解讀等步驟[7]。近年來，mNGS 逐漸被應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的早期診斷[8，9]，并取得了良好的效果。目前關(guān)于腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）mNGS 技術(shù)在TBM 早期診斷的應(yīng)用研究雖然不多，但也取得了一些進(jìn)展，現(xiàn)將腦脊液mNGS 在TBM 早期診斷中的應(yīng)用綜述如下。

1 mNGS 技術(shù)常用原理

自1977 年Sanger F 等[10]發(fā)明雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA 測(cè)序以來，人類開始進(jìn)入測(cè)序時(shí)代。核酸測(cè)序?qū)ι茖W(xué)、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)發(fā)展的創(chuàng)造性和重要性，推動(dòng)了人們對(duì)更高效、更準(zhǔn)確和更低成本技術(shù)的不斷探索。近些年來不斷有新的技術(shù)平臺(tái)誕生，包括核酸測(cè)序在內(nèi)的基因組學(xué)在容量、速度及應(yīng)用方面均有長(zhǎng)足的發(fā)展[11]。目前，Illumina 公司的HiSeq、MiniSeq、NextSeq 等測(cè)序平臺(tái)在市場(chǎng)上占主流地位，這些平臺(tái)的測(cè)序原理均采用合成測(cè)序技術(shù)（sequencing by synthesis，SBS）[12]。

在DNA 復(fù)制過程中，DNA 聚合酶將自由堿基逐個(gè)連接，形成一條與DNA 模板鏈互補(bǔ)的新鏈。而SBS 的核心就是對(duì)DNA 模板鏈（即待測(cè)序DNA）和自由堿基的加工處理，即“DNA 簇”和“可逆性末端終止”技術(shù)[13]。DNA 簇是指每個(gè)DNA 片段等溫?cái)U(kuò)增的過程。首先用超聲波把待測(cè)序DNA 鏈打斷成若干條都含幾百個(gè)堿基的DNA 片段，其次在DNA 片段兩端接入寡核苷酸接頭，通過接頭與寡核苷酸錨配對(duì)將片段固定到玻片表面后，解離雙鏈，形成一端固定在玻片上的DNA 單鏈，然后另一端的接頭與錨配對(duì)亦連接到玻片上，形成“橋”式結(jié)構(gòu)，最后通過聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)（即橋式PCR 技術(shù)）制備成單克隆DNA 簇群。可逆性末端終止技術(shù)是將修飾（含不同顏色熒光標(biāo)記及可逆性末端終止基團(tuán)）的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）作為底物完成單堿基配對(duì)、測(cè)序的方法，每次反應(yīng)都包含DNA 聚合酶和修飾dNTP 的滲入、合成鏈延伸一個(gè)堿基、單堿基熒光顯微鏡采集熒光信號(hào)和已連接dNTP 恢復(fù)延伸功能及洗滌熒光標(biāo)記的過程，重復(fù)進(jìn)行滲入、延伸、采集、恢復(fù)4 個(gè)步驟，最后通過解讀不同熒光顏色，獲得DNA 的精準(zhǔn)序列[14]。

2 腦脊液mNGS 在TBM 早期診斷中的應(yīng)用

病原菌檢測(cè)是目前確診TBM 的主要方法。常用的TBM 病原菌檢測(cè)方法有腦脊液AFB、腦脊液MTB 培養(yǎng)及XpertMTB/RIF 方法等。CSF 作為一種無菌性體液，在感染狀態(tài)下，MTB 含量較少，AFB 檢測(cè)陽(yáng)性率較低，在Sun WW 等[15]進(jìn)行的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率僅為2.91%；目前，腦脊液MTB 培養(yǎng)仍是TBM 診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于MTB 細(xì)胞壁的脂質(zhì)含量相對(duì)較高，影響了營(yíng)養(yǎng)素的吸收，導(dǎo)致細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)耗時(shí)在2～4 周以上，對(duì)TBM 早期診斷的價(jià)值有限[16]。XpertMTB/RIF 方法是一種快速、高靈敏度的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)，同時(shí)可進(jìn)行利福平敏感性測(cè)驗(yàn)，2015 年WHO 推薦其用于TBM 的早期診斷，其結(jié)果陽(yáng)性時(shí)可用于TBM 的早期診斷，但陰性結(jié)果不能用于排除診斷[17]。這些方法均不能滿足臨床診斷的需要，而mNGS 可以對(duì)血液、肺泡灌洗液、腦脊液、胸腹水、尿液、糞便、分泌物等多種標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲及非典型病原微生物的無假設(shè)、快速、平行檢測(cè)，尤其對(duì)培養(yǎng)困難、病情危重的感染性疾病有獨(dú)特價(jià)值[18]。從2014 年Wilson MR 等[19]首次使用mNGS 診斷1 例鉤端螺旋體腦膜炎的重癥免疫缺陷兒童以來，腦脊液mNGS技術(shù)逐漸開始應(yīng)用于TBM 的早期診斷領(lǐng)域。

2.1 成人TBM 早期診斷 一直以來，TBM 的早期診斷都是困擾臨床醫(yī)生的難題，而早期診斷對(duì)于減少TBM 患者的致死率和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥又有相當(dāng)重要的價(jià)值[2]。2020 年Xing XW 等[20]報(bào)道的腦脊液mNGS 用于213 例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者診斷的前瞻性病例研究中，在TBM 組中（共44 例TBM 患者），當(dāng)以屬特異性讀數(shù)量≥1 為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，mNGS的真陽(yáng)性率為27.3%，真陰性率為96.4%，總符合率為82.2%，受試者工作曲線的曲線下面積最大（0.619,95%CI=0.516～0.721）；44 例患者的腦脊液AFB 及MTB 培養(yǎng)結(jié)果均是陰性，腦脊液Xpert MTB/RIF 陽(yáng)性率為16.13%；聯(lián)合mNGS 和Xpert MTB/RIF 陽(yáng)性率為29.55%；雖然腦脊液mNGS 的陽(yáng)性率仍不高，但高于現(xiàn)有的其它檢測(cè)手段，且其特異性較高，可用于TBM 的早期診斷和排除診斷。Lin A等[21]報(bào)道的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究顯示，對(duì)50 例不合并HIV 的懷疑TBM 成人患者進(jìn)行腦脊液mNGS 檢測(cè)，20 例檢測(cè)出MTB；以傳統(tǒng)的診斷方法（包括腦脊液培養(yǎng)和AFB 染色）和Xpert MTB/RIF 為金標(biāo)準(zhǔn)，22 例患者確診為TBM，其中mNGS 的敏感性為63.6%（14/22）；以最終臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，在22 例確診TBM 患者和12 例臨床診斷TBM 患者中，mNGS 的敏感性為58.8%（20/34），16 例排除TBM患者中，mNGS 結(jié)果均為陰性，特異性為100%，而傳統(tǒng)診斷方法和Xpert MTB/RIF 的敏感性分別為29.4%（10/34）、38.2%（13/34）；mNGS 診斷的敏感性高于傳統(tǒng)診斷方法及Xpert MTB/RIF 法。Sun W 等[22]的關(guān)于mNGS 用于診斷肺外結(jié)核的回顧性研究顯示，mNGS 對(duì)TBM 的敏感性明顯高于其它肺外結(jié)核病，達(dá)到了84.44%，提示mNGS 對(duì)不同類型標(biāo)本的MTB 診斷效果不同，以腦脊液最佳，而且對(duì)比抗結(jié)核治療前、后mNGS 的陽(yáng)性檢出率，提示抗結(jié)核治療對(duì)mNGS 的敏感性無明顯影響。

2.2 兒童TBM 早期診斷 兒童神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，導(dǎo)致MTB 侵入兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)后起病隱匿，早期臨床癥狀多不典型，加之患兒配合程度差，體液量相對(duì)較少，及傳統(tǒng)的腦脊液AFB 和MTB 培養(yǎng)法在兒童中的敏感性遠(yuǎn)低于成人，這些均給兒童TBM 的早期診斷增加了難度[23]。張芙蓉等[24]報(bào)道的1 例以“頭暈1 周、嘔吐4 天”為主訴的10 歲患兒，初步考慮為顱內(nèi)占位，入院后病情進(jìn)展迅速，意識(shí)障礙加重，完善腦脊液常規(guī)、生化檢驗(yàn)及顱腦MRI 檢查后考慮為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，而第1 次結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核感染T 細(xì)胞試驗(yàn)、腦脊液AFB 均為陰性，給予抗病毒治療后，患兒癥狀無明顯改善，隨后腦脊液mNGS 檢測(cè)，檢測(cè)到MTB 基因序列，且未檢出其它病原微生物序列，給予抗結(jié)核治療后癥狀很快好轉(zhuǎn)，最終診斷為TBM 合并血管炎，提示腦脊液mNGS 可應(yīng)用于兒童不典型TBM 的早期診斷。錢喬喬等[25]收集的5 例9 月齡～13 歲患兒中，臨床表現(xiàn)不典型，腦脊液生化檢驗(yàn)不是TBM 典型表現(xiàn)，多次行AFB 均為陰性，行腦脊液mNGS 檢查后均檢出MTB，診斷為TBM，其中有1 位患兒因病情危重，家長(zhǎng)放棄治療后死亡，余給予抗結(jié)核治療后癥狀均明顯好轉(zhuǎn)，表明mNGS 有助于早期精準(zhǔn)診斷TBM，改善患兒預(yù)后。

2.3 合并HIV 的TBM 早期診斷 TBM 可以影響所有人群，但在HIV 患者和兒童中尤其常見[26]。由于免疫功能缺陷，HIV 患者合并TBM 的可能性是其他患者的5 倍，病死率可達(dá)60%[6]，而早期識(shí)別、早期診斷及適當(dāng)?shù)闹委熓歉纳祁A(yù)后的基礎(chǔ)，因而早期診斷TBM 對(duì)合并HIV 患者尤為重要。在診斷過程中，應(yīng)注意患者的免疫功能狀態(tài)，因?yàn)槊庖呷毕輰?duì)不同診斷方法的敏感度及特異度均有一定的影響。Chen J等[27]對(duì)88 例疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的HIV 患者進(jìn)行的一項(xiàng)回顧性性研究中，通過腦脊液涂片、培養(yǎng)及mNGS 等方法有73 例最終實(shí)現(xiàn)病原微生物的診斷，其中mNGS 診斷50 例，陽(yáng)性率為56.8%，包括巨細(xì)胞性腦炎、單純性皰疹病毒性腦炎、隱球菌性腦膜炎等，同時(shí)mNGS 確診患者CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于未確診者，mNGS 可能更適合CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低的患者；在18 例以癥狀、其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和試驗(yàn)性治療的效果診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者中，mNGS 未發(fā)現(xiàn)病原體，其中包括8 例臨床懷疑為TBM 患者（AFB 及XpertMTB/RIF 均為陰性），mNGS最常見的漏診疾病是臨床懷疑的TBM；回顧其mNGS 檢測(cè)方法，考慮與腦脊液樣本核酸提取方法有關(guān)。結(jié)核桿菌是一種胞內(nèi)菌，需要采用特殊的破壁方式，才能提取出結(jié)核桿菌DNA。

3 腦脊液mNGS 應(yīng)用于TBM 早期診斷存在的不足

雖然mNGS 技術(shù)在TBM 早期診斷中發(fā)揮著愈發(fā)重要的作用，但在其使用過程中仍存在很多不足。①樣本離心處理：MTB 是一種較難進(jìn)行核酸測(cè)序的病原菌，其在腦脊液中繁殖速度慢、細(xì)菌含量少，導(dǎo)致mNGS 陽(yáng)性率不高。Ji XC 等[28]對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行離心，提取上清液用于測(cè)序，減低了人源基因的比例，提高了mNGS 對(duì)MTB 的靈敏度。故對(duì)高度懷疑TBM 者，先進(jìn)行腦脊液樣本離心處理，選用離心后上清液進(jìn)行mNGS，以提高測(cè)序靈敏度；②樣本破壁處理：mNGS 首先要盡可能獲得樣本中所含的全部核酸信息，而MTB 作為一種胞內(nèi)菌，其細(xì)胞壁厚，常規(guī)破壁方式處理后其核酸釋放效率低，是導(dǎo)致MTB 檢出率低的1 個(gè)重要原因，因此，應(yīng)對(duì)臨床上不能排除MTB 感染者，加用特殊破壁方式處理樣本，以提高M(jìn)TB 檢出率；③測(cè)序結(jié)果可靠性：測(cè)序結(jié)果可靠性主要由最小測(cè)序深度所決定[14]。最小測(cè)序深度是指測(cè)序過程中某段序列被檢測(cè)到的最少次數(shù)，以確保獲得全部基因信息。最小測(cè)序深度越大，其可靠性就越高，同時(shí)成本亦越高，所以確定不同體液樣本的最佳最小測(cè)序深度就尤為重要。目前，腦脊液的最佳測(cè)序深度沒有明確的界定，臨床醫(yī)生及科研人員應(yīng)進(jìn)一步開展大型前瞻性試驗(yàn)研究，從而明確腦脊液的最佳最小測(cè)序深度，從而控制成本，提高腦脊液mNGS 的準(zhǔn)確性；④陽(yáng)性結(jié)果的判定：目前檢測(cè)結(jié)果解讀缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需要專業(yè)的微生物專家根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室具體情況解讀，帶有一定的誤判率，應(yīng)建立臨床醫(yī)生與微生物專家之間的高效聯(lián)絡(luò)，尤其是檢測(cè)出多種病原菌，在判定致病菌時(shí)，從而做出更真實(shí)的判定；對(duì)MTB 等較難測(cè)序的微生物，檢出一條特異序列即可認(rèn)定為陽(yáng)性，但仍需根據(jù)臨床癥狀及檢測(cè)結(jié)果判定是否有多重感染可能；⑤指導(dǎo)用藥：mNGS 與培養(yǎng)不同，不能進(jìn)行細(xì)菌體外藥敏試驗(yàn)，直接指導(dǎo)臨床用藥；但對(duì)TBM 患者，診斷耐藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)降低其死亡率至關(guān)重要[29]。可對(duì)檢測(cè)出的MTB 進(jìn)行已知耐藥基因靶向測(cè)序，篩選出耐藥基因，再根據(jù)藥敏檢測(cè)表型結(jié)果，得出關(guān)鍵的耐藥基因，結(jié)合藥物的作用機(jī)理和耐藥基因的耐藥機(jī)理，給出用藥建議，同時(shí)可進(jìn)行體外驗(yàn)證。

4 總結(jié)與展望

近年來隨著社會(huì)的進(jìn)步、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，TBM 的發(fā)病率較前有所下降，但其對(duì)人類健康的危害不容小視，尤其目前TBM 的早期診斷方法仍存在許多不足之處。近年來隨著mNGS 技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用，其在TBM早期診斷方面表現(xiàn)出許多優(yōu)勢(shì)，但仍需要更多的臨床研究來證明其效用，同時(shí)制訂統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果解讀指南，進(jìn)一步降低成本，更好的服務(wù)臨床。