外泌體攜帶的microRNAs在乳腺癌中的作用

廖若蕙，沈國雙

（青海大學附屬醫(yī)院乳腺疾病診療中心，青海 西寧 810000）

乳腺癌（breast cancer）是導致女性癌癥相關死亡的首要原因，自1989 年到2017 年全球女性乳腺癌發(fā)病率上升了40%。2020 年由美國國際癌癥研究機構發(fā)布的數據顯示，預計乳腺癌發(fā)病率約占女性惡性腫瘤的30%，死亡率約占女性惡性腫瘤的15%[1]。外泌體最初被認為是從腫瘤細胞系釋放的含有5-核苷酸酶活性的微囊泡[2]，隨著研究不斷深入，近年來有學者發(fā)現外泌體是一種細胞外囊泡（EVs），膜直徑為30～100 nm，呈杯狀外觀[3]，幾乎所有的真核細胞都能分泌外泌體，且在癌細胞中的表達量相比于正常體細胞更高[4，5]。外泌體包裹了許多生物大分子，包括非編碼基因家族（microRNA，lncRNA）、蛋白質和脂質等[6]。miRNA 是在轉錄后水平通過結合其靶信使RNA 的3'-UTR 來抑制表達，其功能障礙會干擾致癌或抑癌靶基因的表達，這與癌癥的發(fā)病機制有關[7]。現有研究表明，miRNAs 可以封裝在外泌體中由腫瘤細胞分泌到腫瘤微環(huán)境中，促進腫瘤與基質的相互作用；或釋放到主要的遠處器官進行循環(huán)，以進行隨后的轉移[8]。本文主要概述乳腺癌中外泌體miRNAs 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉移侵襲、治療等方面的重要作用，以期今后為臨床應用這些潛在的生物標志物提供參考。

1 外泌體miRNA 在乳腺癌生長增殖中的作用

1.1 營養(yǎng)代謝是腫瘤細胞生長的重要條件 腫瘤細胞在生長過程中需要大量營養(yǎng)物質來支持其能量需求和生物合成。Yan W 等[9]研究發(fā)現將含有高或低水平miR-105 的外泌體（Exosome，Ev）注射到小鼠乳腺癌細胞的生長部位后，腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）模型中乳酸、乙酸和谷氨酸的細胞內水平都升高；將高水平組miR-105 外泌體與其他對照組相比，該組小鼠乳腺癌生長速度和乳腺癌細胞的增殖明顯增強。體內數據表明，外泌體miR-105 重編程的CAFs 可產生更多代謝產物滋養(yǎng)腫瘤細胞，促進其生長。

1.2 向正常細胞轉移促進癌癥進展 Wang B 等[10]發(fā)現，外泌體攜帶的miR-1910-3p 能促進乳腺癌細胞向乳腺正常上皮細胞的增殖和遷移。在體外，富含miR-1910-3p 的外泌體通過轉移到正常乳腺上皮細胞中，誘導細胞自噬、抑制細胞凋亡。在體內，其通過下調肌小管相關蛋白3，激活NF-κB 和Wnt/βcatenin 信號通路，促進乳腺癌進展。該研究表明，高水平的miR-1910-3p 可誘導乳腺癌細胞自噬，抑制細胞凋亡；而低水平的miR-1910-3p 表達可降低自噬，增加細胞凋亡，抑制其增殖和遷移能力。

1.3 抑制局部免疫促進腫瘤生長 Xing F 等[11]研究發(fā)現，在乳腺癌腦轉移瘤患者體內X-滅活特異性轉錄本（X inactivate-specific transcript，XIST）顯著下調，XIST 的缺失增加了外泌體miR-503 的分泌，同時外泌體miR-503 能夠通過調節(jié)NF-κB 通路，將小膠質細胞從M1 型轉化為M2 型。M2 巨噬細胞可以通過表達細胞程式死亡-配體1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）來抑制T 細胞免疫[12，13]，進而增強其PD-L1 的表達，抑制局部免疫，促進腫瘤生長。

2 外泌體miRNA 在乳腺癌轉移侵襲中的作用

2.1 外泌體miRNA 是腫瘤轉移的介質 許多研究表明，外泌體miRNA 在癌癥轉移中起著非常重要的作用。Singh R 等[14]比較了轉移性MDA-MB-231 細胞和非惡性人正常乳腺細胞，發(fā)現在144 個與癌癥相關的miRNA 中，內源性的miR-10b 在MDA-MB-231 細胞中顯著表達，而在非惡性人正常乳腺細胞中表達極低。同樣，miR-10b 在細胞外（即外泌體）也有類似的表達模式，這表明miR-10b 可以被MDAMB-231 細胞活躍分泌。該研究還發(fā)現，外泌體miR-10b 可以從供體細胞轉移到受體細胞，表明miRNAs 可以通過外泌體在各種類型細胞間水平轉移，證明其在乳腺癌侵襲轉移中發(fā)揮著重要作用。

2.2 外泌體miRNA 介導腫瘤免疫逃逸 誘導免疫抑制可以促進腫瘤的生長和侵襲，骨髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在腫瘤逃離宿主免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用[15]。Jiang M 等[16]研究發(fā)現，乳腺癌細胞來源的外泌體可以分泌大量miR-181a 和miR-9，阻斷這些外泌體的釋放可完全減弱miRNAs 介導的對MDSCs 發(fā)育的調控。這兩種miRNAs 通過增強MDSCs 原位浸潤使未成熟MDSCs 擴增，從而促進乳腺癌細胞生長和免疫逃逸，其對T 細胞免疫有強烈的抑制作用，最終可導致腫瘤細胞的生長及侵襲。

2.3 通過細胞轉型促進腫瘤轉移 Xing F 等[11]分析了乳腺癌腦轉移瘤患者中的長鏈非編碼RNA，發(fā)現XIST 在這些組織中表達下降，其表達水平與腦轉移呈負相關。在異種移植模型中發(fā)現，小鼠乳腺中XIST 的缺失會加速原發(fā)腫瘤的生長，并促進腦內轉移的發(fā)生。XIST 的缺失同時會促進外泌體miR-503的分泌，外泌體miR-503 也由X 染色體編碼且通過調節(jié)STAT3 和NF-κB 通路，將小膠質細胞從M1 型重編程為M2 型，M2 小膠質細胞已被報道通過釋放細胞因子和生長因子促進腦腫瘤的進展[17，18]。這些研究證明了外泌體miR-503 水平與腦轉移狀態(tài)呈正相關。

3 外泌體miRNA 在腫瘤微環(huán)境中的調控作用

3.1 外泌體miRNA 可形成特有的腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境通常指與實性腫瘤存在距離較近的區(qū)域。1989 年佩吉特首次提出著名的“種子和土壤”假說，使微環(huán)境與腫瘤之間的關系引起了廣泛關注，該假說認為，只有當癌細胞與潛在轉移（種子）所兼容的器官微環(huán)境（土壤）共同存在時發(fā)才會發(fā)生腫瘤轉移[19，20]。Melo S 等[21]研究發(fā)現，乳腺腫瘤細胞的外泌體可以形成特有的腫瘤環(huán)境，然后在其內部生成成熟的miRNAs。當非致瘤性乳腺上皮細胞（MCF-10A）和這些外泌體（MDA-MB-231）共培養(yǎng)時，正常細胞會發(fā)生癌變。Baroni S 等[22]研究表明，外泌體可以將腫瘤分泌的miR-9 轉移到受體正常的成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs），miR-9 在乳腺癌細胞中顯著上調且直接靶向于鈣黏蛋白（CDH1），miR-9可參與微環(huán)境重編程，激活正常成纖維細胞的腫瘤促進能力，進而增加癌細胞的活力和侵襲性。

3.2 外泌體miRNA 誘導微環(huán)境代謝 乳腺癌細胞可作為代謝寄生蟲，從局部脂肪細胞中獲取能量和生物量。有研究表明[23]，來自脂肪細胞的外泌體攜帶的蛋白質通過增加脂肪酸氧化（FAO）促進癌細胞的遷移和侵襲。Wu Q 等[24]研究發(fā)現，含有miR-144 和miR-126 的外泌體在與脂肪細胞共培養(yǎng)的乳腺癌細胞中高度分泌，外泌體miR-144 通過下調MAP3K8/ERK1/2/PPARγ 軸來促進米色/棕色脂肪細胞分化；外泌體miR-126 通過干擾IRS/Glut-4 信號通路，激活AMPK/自噬通路、控制脂肪細胞中HIF-1α 的表達來重塑代謝。此外，在氧化應激和缺氧條件下，外泌體分泌miR-126 增多，表明癌細胞的外泌miR-126 可能參與了腫瘤血管生成和惡性轉化[25，26]。

4 外泌體miRNA 對乳腺癌血管的影響

Pakravan K 等[27]研究發(fā)現，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源的外泌體以劑量依賴的方式誘導乳腺癌細胞中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 轉錄水平下調；該研究發(fā)現，miR-100 由MSC 分泌的外泌體攜帶并運輸，可顯著抑制mTOR 和HIF-1α 在mRNA和蛋白上的表達，且乳腺癌細胞中miR-100 和VEGF 的表達水平呈負相關[28]。這些結果表明，VEGF 的下調是特異性的，很大程度上依賴于外泌體攜帶的miRNA 的轉移。此外，miR-100 的誘導作用可以抵消上皮間充質轉化（EMT）誘導轉錄因子的促瘤作用，從而調控不同的基因參與腫瘤的發(fā)生[29]。該研究發(fā)現，使用anti-miR-100 可以挽救MSC 來源的外泌體對VEGF 表達的抑制作用，證實了外泌體攜帶miR-100 在乳腺癌細胞中調控VEGF 表達中的抑制作用。不僅如此，Pan S 等[30]的研究發(fā)現，與對照組比較，外泌體miR-145 明顯增加人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）形成，故MDA-MB-231 細胞衍生的自身外泌體對其內皮細胞的增殖有顯著作用，可促進腫瘤血管生成。

5 外泌體miRNA 有望成為診斷乳腺癌及預后的指標

目前，臨床上關于乳腺癌的診斷主要依靠于病理及影像學指標，但因其有創(chuàng)性、對開展技術所需的人員水平和設備要求高以及費用問題等，導致乳腺癌的早期診斷率仍然不理想，因此需要引入新的生物標志物來克服相關限制。因外泌體包裹的分子在非生理環(huán)境中也能表現出與眾不同的穩(wěn)定性和耐藥性[31]，使其可以成為監(jiān)測疾病有前途的生物標志物[32]。有研究證實[14]，乳腺癌患者血清中外泌體miR-1910-3p 的表達明顯高于健康志愿者，且患者體內血清CA153 的診斷靈敏度為68%，特異性為60%；血清外泌體中miR-1910-3p 的診斷敏感度為88%，特異性為76%。這些數據表明，血清外泌體miR-1910-3p 的診斷效果明顯高于傳統(tǒng)的腫瘤標志物CA153，可作為乳腺癌的新分子檢測方法。

6 外泌體miRNA 在乳腺癌治療及耐藥中的作用

由于外泌體具有穩(wěn)定、通透性強、免疫原性差、毒性小、生物相容性差等特性，目前可被模擬作藥物傳遞系統(tǒng)的納米顆粒載體[31]。有研究證實[33]，化療藥物和小干擾RNA 已成功封裝在外泌體中且成功用于靶向乳腺癌、胰腺癌、肺癌和前列腺癌的治療。有研究將MDA-MB-231 細胞與表達miR-148b-3p 的人類臍帶間充質干細胞衍生的外泌體共培養(yǎng)，發(fā)現攜帶miR-148b-3p 的外泌體在體外對MDA-MB-231 的進展有抑制作用[34]，這凸顯了含有miR-148b-3p 的外泌體對乳腺癌的治療潛力。另外，外泌體miR-423-5p 在三陰性乳腺癌細胞中對順鉑具有耐藥性[35]；外泌體miR-222 可使阿霉素敏感的乳腺癌細胞對阿霉素產生耐藥性，但外泌體miR-770 過表達可通過誘導細胞凋亡增強三陰性乳腺癌細胞系對阿霉素的敏感性[36]；外泌體miR-222 和miR-221也可使他莫西芬敏感的乳腺癌細胞對他莫西芬產生耐藥性[37]。這些研究證實了外泌體miRNAs 在乳腺癌轉移和耐藥中的重要性，也為開展基于外泌體miRNA 的癌癥治療方法的研究提供了理論基礎。

7 展望

外泌體miRNAs 受膜泡的保護作用，其在血液和其他體液中的含量較穩(wěn)定，因此有望成為早期診斷乳腺癌的無創(chuàng)生物標志物[38]。此外，外泌體miRNAs 可通過促進腫瘤細胞免疫逃逸和促進腫瘤微環(huán)境改變等途徑提高腫瘤細胞的侵襲性。但目前外泌體miRNAs 提取并不能完全適用于臨床，有學者從RQ-PCR 的廣泛周期閾值中發(fā)現，不同人群的外泌體miRNAs 表達水平有顯著差異[39]，這種變異會影響外泌體miRNAs 作為乳腺癌生物標記物的臨床適用性，且患者的基礎疾病等也可能影響miRNAs 的水平，從而該項檢測缺乏特異性[40]。此外，現階段獲取外泌體miRNA 方式主要以超離心分離技術為主，其設備成本高、運行時間長、可移植性低，這在一定程度上也限制了該技術的推廣應用。

8 總結

外泌體miRNAs 直接參與了乳腺癌的發(fā)生、轉移及耐藥，其可作為一種可被定量檢測的，新的乳腺癌生物標志物。但由于人群特異性和檢測技術等限制，該技術目前尚未在臨床廣泛應用。因此，如何快速便捷的獲取外泌體miRNA，并提高外泌體miRNAs 作為乳腺癌診斷生物標志物的靈敏度和特異性是未來的研究方向。