ELISA在獸醫(yī)實驗室檢測的應用

黃 雨，寧璐璐

（西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院 712100）

夏商周時期甚至更早之前，人類就知道診斷并治療疾病，最初主要依靠對表面現(xiàn)象的觀察和簡單經(jīng)驗的積累。現(xiàn)代醫(yī)學診斷學是在物理、化學等基礎學科以及微生物學發(fā)展的基礎上逐漸形成的更為精細的診斷學，因為顯微鏡的方面而研制出細菌分離培養(yǎng)、血清學診斷法，提高了疾病診斷的科學性和準確性。近年來，細菌學、病毒學、血清學、免疫學等迅速發(fā)展，由此也創(chuàng)建了針對特定的生物學病原的實驗室檢查、診斷方法和技術，顯著地提高了獸醫(yī)臨床診斷的準確性、科學性和應用價值。1971年，Engvall和Perlmann分別研發(fā)出了酶聯(lián)免疫吸附試驗，即ELISA，可用于檢測體液中微量物質(zhì)。ELISA是疾病診斷中的一種新方法，不僅可以檢測特異性抗原，如病毒、細菌、寄生蟲或者是血清中的激素水平，還可用于定量或定性地檢測血清中的抗體水平，現(xiàn)已在多種疾病的臨床診斷方面得到推廣。目前使用結(jié)果顯示，ELISA具有敏感性強、特異性高、簡便快速且易于自動化操作等特點，不僅適用于臨床疾病診斷，而且也適用于流行病學調(diào)查。ELISA可用于檢測抗原或抗體，現(xiàn)已作為一種對疾病進行早期診斷的快速檢測技術，對于有效診治及防控動物疾病具有重要意義。

1 ELISA的基本原理與分類

杜敏等[1]介紹了實驗室常規(guī)ELISA檢測的基本原理、操作要領及注意事項。ELISA的基本原理是利用抗原-抗體特異性反應，把某種抗原（或抗體）吸附于固相載體表面，再用某種特定酶標記抗原或抗體，測定時將受檢樣品和酶標抗原或抗體根據(jù)不同的方法依次與包被在固相載體上的抗原或抗體進行反應，形成抗原抗體復合物，洗去多余物質(zhì)，加入底物后，底物被固相載體上的酶催化成有色產(chǎn)物，根據(jù)有色產(chǎn)物的量來確定待檢樣品中抗原或抗體的有無及多少。由于酶催化效率很高，間接地放大了免疫反應效果，從而使這種檢測方法具有很高的敏感度。經(jīng)過多位研究人員的改進與優(yōu)化，目前常用的ELISA有間接ELISA（常用于檢測抗體）、夾心ELISA（常用于檢測大分子抗原）、競爭ELISA（常用于檢測小分子抗原）等。

2 ELISA在幾種動物疾病檢測中的應用

2.1 ELISA在犬細小病毒病檢測的應用

犬細小病毒病（Canine Parvovirus Disease，CPVD）是犬細小病毒（Canine Parvovirus，CPV）引起犬的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病，各種年齡段的犬均可感染，斷乳前后的幼犬極為易感，臨床特征以出血性腸炎和非化膿性心肌炎為主，具有較高的發(fā)病率和致死率，對犬類的健康造成了極大的危害，同時也給我國養(yǎng)犬業(yè)帶來了重大的損失。因此，對隱性感染CPV的犬和發(fā)病犬進行早期快速診斷，對預防該病的流行具有重大意義。

目前可根據(jù)血液學檢查結(jié)果和臨床癥狀對感染犬進行初步診斷，運用血凝與血凝抑制試驗、血清中和試驗、免疫擴散試驗、ELISA等可對CPVD進一步確診。其中酶聯(lián)免疫吸附試驗因特異性強、敏感度高、易操作而廣泛應用于犬細小病毒病的快速診斷。在國外已有商品化試劑盒，國內(nèi)也有多位學者已研制出快速診斷試劑盒。CPV診斷的ELISA方法包括間接法、抗原競爭法、Dot-ELISA等。由姜騫[2]等研制的犬細小病毒ELISA抗體檢測試劑盒，是將大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得的CPV-2 VP2蛋白經(jīng)親和層析柱純化后，以此為包被抗原創(chuàng)建的檢測CPV抗體的間接ELISA法，試驗結(jié)果表明該方法具有良好的重復性，準確性以及特異性。除此之外，劉劍郁[3]等研發(fā)的間接ELISA法是用犬腎細胞增殖犬細小病毒，純化后作為包被抗原;國內(nèi)也有學者建立了Dot-ELISA法診斷CPV，并發(fā)現(xiàn)其敏感性比常規(guī)ELISA更高。由此可見，ELISA技術現(xiàn)已成為一種廣為應用的快速診斷CPV的方法。

2.2 ELISA在貓免疫缺陷病診斷的應用

貓免疫缺陷病（FID）又被稱為貓艾滋病，是由貓免疫缺陷病毒（FIV）引起貓的慢性接觸性傳染病，該病毒導致機體免疫力下降，病貓常表現(xiàn)出發(fā)熱、口炎、腹瀉以及神經(jīng)癥狀等，并伴有各種繼發(fā)性寄生蟲疾病[4]。盡管FIV致死率極高，但是對感染的貓進行恰當?shù)闹委熆裳娱L病貓的生命，因此貓免疫缺陷病的早期確診具有十分重要的意義。

FIV具有很長的潛伏期，貓感染后出現(xiàn)的臨床癥狀大多是由于機體免疫系統(tǒng)被破壞，其他病原趁機襲入機體導致繼發(fā)性感染的結(jié)果，所以其他一些與貓有關的疾病的臨床癥狀在感染FIV的貓上均有所體現(xiàn)，因此僅憑臨床癥狀的觀察無法進行FIV的準確診斷。據(jù)報道，目前該病的確診主要依靠病毒分離和抗體檢測。病毒分離培養(yǎng)法是確診該病的最佳方法，但因其檢測周期長而不常用;ELISA技術由于具有較強的特異性、較高的敏感性、操作簡便、快速、成本低、易于大量檢測，是目前應用較多的一種檢測方法，主要通過全血、血清或血漿等樣本檢測病毒p15和p24蛋白的特異性抗體。潘美喬[5]運用ELISA和PCR兩種方法共同檢測了在哈爾濱和上海市收集到的274只流浪貓感染FIV情況，結(jié)果顯示11只為陽性，陽性總檢出率為4%。趙莎莎[6]采用免疫熒光試驗和ELISA檢測感染貓血清中抗體，研究表明采用ELISA檢出抗體比免疫熒光試驗更早，而且滴度高，但也會存在假陰性的情況。Natasa[7]等通過酶聯(lián)免疫吸附測定和聚合酶鏈反應對42只家貓進行FIV感染患病率調(diào)查。通過ELISA試驗檢查的42只貓中，F(xiàn)IV抗體血清反應陽性的有14只（33.3%），在PCR分析中，F(xiàn)IV陽性的有11只（26.2%）。FIV陽性貓的平均年齡為6歲，其中室外貓(65%FIV)和雄貓(71.4%FIV)的感染率較高。這項研究中使用的兩種測試的結(jié)果均表明，斯洛文尼亞的貓中感染的患病率均很高，并且發(fā)現(xiàn)ELISA方法可用作快速檢測FIV感染的篩選測試。

2.3 ELISA在犬心絲蟲病診斷的應用

犬心絲蟲又名犬惡絲蟲，寄生于犬等其他動物的右心室及肺動脈內(nèi)（少見于胸腔、支氣管），其成蟲寄生于心臟內(nèi)，引起循環(huán)障礙，呼吸困難及貧血等癥狀，最終致死。心絲蟲是動物心血管系統(tǒng)中最常見的寄生蟲之一，除犬以外，貓及其他野生動物也易感[8]，美國、日本均出現(xiàn)過相關報道，在我國也分布甚廣，北至沈陽，南至廣州均有發(fā)現(xiàn)。葉青華和陳濤[9]首次在國內(nèi)使用商品化犬心絲蟲快速檢測試劑盒(ELISA法)，同時也采用了改良Knott’s法對四川省境內(nèi)的128只工作犬(包括警犬和護衛(wèi)犬)進行了感染率調(diào)查，其感染率分別為20.31%和5.47%，結(jié)果表明ELISA法檢測效果明顯優(yōu)于改良Knott’s法，同時也證明四川盆地是犬心絲蟲病的流行區(qū)域。

甄森萍[10]等介紹了目前常用的犬心絲蟲病的檢查方法，包括直接檢查、血涂片檢查法、淡黃層檢查法、改良Knott's技術、過濾技術、酶聯(lián)免疫吸附法等10余種實驗室檢查方法，并表明酶聯(lián)免疫吸附法的更具有優(yōu)勢。姜鑫[11]等建立了基于重組MTFP基因蛋白的犬心絲蟲抗體Dot—ELISA檢測方法，結(jié)果表明該方法敏感性高、重復性好、特異性強，并且可直接觀察結(jié)果，易于在基層檢疫工作中推廣，為犬心絲蟲病的臨床診斷提供了一種切實可行的新方法。

3 總結(jié)

動物疾病臨床診斷常用的細菌培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)等微生物檢查方法特異性雖強，但費時費力，檢測成本高且不易推廣;聚合酶鏈式反應受影響因素很多，結(jié)果不穩(wěn)定，精確度低;免疫膠體金技術、乳膠凝集試驗、血凝試驗快速簡便易操作但敏感性較低。ELISA方法特異性強、敏感性高、快速簡便，在獸醫(yī)臨床、流行病學調(diào)查中應用越來越多，技術也越來越成熟，相關檢測試劑盒陸續(xù)被開發(fā)和應用。但該技術的穩(wěn)定性亟待提高，操作過程中各個環(huán)節(jié)均可對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因此技術操作的規(guī)范化與標準化顯得尤為重要。這樣才能使得不同實驗室與不同操作員得到的檢測結(jié)果均具有參考價值，進而更好地應用于獸醫(yī)臨床疾病診斷和生產(chǎn)實踐。